Giardia duodenum on loisorganismi, joka aiheuttaa giardiaasia, suolistotulehdusta, joka on erityisen yleinen pienillä lapsilla, joilla on ripulin kliinisiä oireita.Olemme aiemmin raportoineet, että solunulkoinen G. duodenalis laukaisee solunsisäisten oligomerisaatiota muistuttavien reseptori 3:n (NLRP3) sitovien nukleotidien aktivoitumisen ja säätelee isännän tulehdusvasteita solunulkoisen vesikkelin (EV) erityksen kautta.Tähän prosessiin osallistuvan patogeeniin liittyvän duodenokokki-EV:n (GEV) tarkat molekyylimallit ja NLRP3-tulehduksen rooli giardiaasissa on kuitenkin vielä selvittämättä.
Rekombinantit eukaryoottiekspressioplasmidit pcDNA3.1(+)-alfa-2 ja alfa-7.3 giardiinit GEV:ssä rakennettiin, transfektoitiin hiiren primaarisiin peritoneaalisiin makrofageihin ja havaittiin mittaamalla tulehduksen kohdemolekyyli kaspaasi-1.p20-ekspressiotaso seulottiin..G. duodenalis alfa-2- ja alfa-7.3-giardiinit tunnistettiin alun perin mittaamalla NLRP3-tulehdus (NLRP3, pro-interleukiini-1 beeta [IL-1β], pro-kaspaasi-1 ja kaspaasi-1 p20), IL-eritys.1β-tasot, apoptoottisen täpläproteiinin (ASC) oligomerisaatiotasot ja NLRP3:n ja ASC:n immunofluoresoiva lokalisaatio.NLRP3-tulehduksen rooli G. duodenalis -bakteerin patogeenisyydessä arvioitiin sitten käyttämällä hiiriä, joissa NLRP3-aktivaatio oli estetty (NLRP3-salpatut hiiret) ja patologisia muutoksia ruumiinpainossa, pohjukaissuolen loiskuormituksessa ja pohjukaissuolen kudoksessa.Lisäksi tutkimme, indusoivatko hiardiinit alfa-2 ja alfa-7.3 IL-1β:n eritystä in vivo NLRP3-tulehduksen kautta ja määritimme näiden molekyylien roolin G. duodenalis -bakteerin patogeenisyydessä hiirillä.
Alfa-2- ja alfa-7.3-giardiinit indusoivat NLRP3-inflammatorisen aktivoitumisen in vitro.Tämä johti p20-kaspaasi-1:n aktivoitumiseen, NLRP3-, pro-IL-1β- ja pro-kaspaasi-1-proteiinien ilmentymistasojen nousuun, merkittävään IL-1β-erityksen lisääntymiseen, ASA-täplien muodostumiseen sytoplasmaan ja ASA:n oligomerisaation induktioon.NLRP3-tulehdus Peniksen menetys pahentaa G. duodenalis -bakteerin patogeenisyyttä hiirillä.Hiirillä, joita hoidettiin kystailla letkuruokinnalla NLRP3-salpatuista hiiristä, ilmeni lisääntynyt määrä trofosoiitteja ja vakavia vaurioita pohjukaissuolen villiin, joille oli tunnusomaista nekroottiset kryptat, joissa oli kutistunut ja haarautunut.In vivo -kokeet ovat osoittaneet, että giardiinit alfa-2 ja alfa-7.3 voivat indusoida IL-1p:n erittymistä NLRP3-tulehduksen kautta, ja immunisaatio giardiinit alfa-2:lla ja alfa-7.3:lla vähensi G. duodenalis -bakteerin patogeenisyyttä hiirissä.
Yhdessä tämän tutkimuksen tulokset viittaavat siihen, että giardia alfa-2 ja alfa-7.3 aiheuttavat isännän NLRP3-tulehduksen lisääntymistä ja vähentävät G. duodenalis -bakteerin tarttuvuutta hiirissä, jotka ovat lupaavia kohteita giardiaasin ehkäisyssä.
Giardia pohjukaissuoli on solunulkoinen alkueläinloinen, joka elää ohutsuolessa ja aiheuttaa vuosittain 280 miljoonaa giardiaasia ja ripulia, erityisesti kehitysmaiden pikkulapsilla [1].Ihmiset saavat tartunnan juomavedestä tai ruuasta, jossa on M. duodenum -kystat, jotka joutuvat sitten mahalaukkuun ja erittyvät mahanesteeseen.Giardia pohjukaissuolen trofosoiitit kiinnittyvät pohjukaissuolen epiteelin päälle aiheuttaen pahoinvointia, oksentelua, ripulia, vatsakipuja ja painon laskua.Henkilöt, joilla on immuunipuutos ja kystinen fibroosi, ovat alttiita infektioille.Infektio voi tapahtua myös suu- ja anaaliseksissä [2].Lääkkeet, kuten metronidatsoli, tinidatsoli ja nitatsoksanidi, ovat edullisia hoitovaihtoehtoja pohjukaissuolen infektioille [3].Nämä kemoterapialääkkeet aiheuttavat kuitenkin haitallisia sivuvaikutuksia, kuten pahoinvointia, karsinogeneesiä ja genotoksisuutta [4].Siksi on kehitettävä tehokkaampia strategioita G. duodenalis -infektion estämiseksi.
Inflammasomit ovat luokka sytosolisia proteiinikomplekseja, jotka ovat osa luontaista immuunivastetta ja auttavat puolustautumaan patogeenien tunkeutumista vastaan ​​ja välittävät tulehdusvasteita [5].Näistä tulehduksista nukleotideja sitovaa oligomerointia (NOD) reseptori 3:n (NLRP3) nukleotideja sitovaa oligomerisaatiota (NLRP3) nukleotideja sitovaa kaltaista tulehdusta on tutkittu laajasti, koska se voidaan havaita erilaisilla patogeeneihin/vaurioihin liittyvillä molekyylikuvioilla (PAMP/). DAMP), tunnistaa ja aktivoi synnynnäisen immuunijärjestelmän.ja säätelee suoliston homeostaasia monissa tulehdussairauksissa [6,7,8].Se koostuu kuviontunnistusreseptorista (PRR) NLRP3, adapteri-apoptoottisesta spotted-proteiinista (ASC) ja efektoriprokaspaasi-1:stä tai prokaspaasi-11:stä.NLRP3-inflammasomi toimii isäntänä patogeenien tunkeutumista vastaan, kuten Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10] ja Leishmania-tutkimuksissa havaittiin.[11], mutta on myös raportoitu, että NLRP3-tulehduksen aktivoituminen rajoittaa suojaavia immuunivasteita ja pahentaa taudin etenemistä esimerkiksi matoilla [12].Aiempien löydöstemme perusteella raportoimme, että ekstrasellulaarinen G. duodenalis laukaisee NLRP3-tulehduksen solunsisäisen aktivaation ja moduloi isännän tulehdusvasteita erittämällä solunulkoisia rakkuloita (EV:itä) [13].NLRP3-inflammasomin rooli G. duodenalis -infektiossa in vivo on kuitenkin vielä määrittämättä.
Giardiinit kuvattiin alun perin G. duodenalis -sytoskeleton rakenneosiksi, ja niillä on tärkeä rooli trofosoiitin liikkuvuudessa ja epiteelisolujen kiinnittymisessä ohutsuolessa.Sopeutuakseen paremmin ympäristöön ja lisätäkseen patogeenisyyttään G. duodenalis trophozoites kehitti ainutlaatuisen sytoskeletaalisen rakenteen, joka koostui 8 siimosta, 1 keskirungosta ja 1 vatsalevystä [14].Giardia pohjukaissuolen trofosoiitit tunkeutuvat ylempään ohutsuoleen, erityisesti pohjukaissuoleen, ja kiinnittyvät enterosyytteihin.Ne liikkuvat jatkuvasti ja kiinnittyvät epiteelisoluihin soluaineenvaihdunnan avulla.Siksi niiden sytoskeleton ja virulenssin välillä on läheinen suhde.Giardia pohjukaissuolille spesifiset giardiinit ovat sytoskeleton rakenteen komponentteja [15] ja ne on jaettu neljään luokkaan: α-, β-, γ- ja δ-giardiinit.α-giardiiniperheeseen kuuluu 21 jäsentä, joilla kaikilla on kalsiumista riippuvainen kyky sitoa fosfolipidejä [16].Ne myös yhdistävät sytoskeleton solukalvoon.Yksilöillä, joilla on G. duodenalis -bakteerin aiheuttama ripuli, α-giardiinit ekspressoituvat voimakkaasti ja immunoreaktiivisia infektion aikana [17].Giardia alfa-1:een perustuvat heterologiset rokotteet suojasivat hiirten giardiaasia vastaan ​​ja ovat mahdollisia kandidaattiantigeenejä rokotteiden kehittämisessä [18].Alfa-8-giardiini, joka sijaitsee plasmakalvossa ja flagellassa, mutta ei vatsavälilevyssä, lisää G. duodenalis -bakteerin trofosoiittien liikkuvuutta ja kasvunopeutta [19].Alfa-14-giardiini kiinnittyy flagellan mikrotubulusrakenteisiin ja vaikuttaa G. duodenalis -bakteerin elinkykyyn [20].Alfa-11-giardiinia esiintyy runsaasti koko elinkaaren ajan, ja alfa-11-giardiinin liiallinen ilmentyminen vahingoittaa itse G. duodenalis -bakteeria [21].On kuitenkin epäselvää, suojaavatko alfa-2-giardiini ja alfa-7,3-giardiini G. duodenalis -infektiota ja niiden taustalla olevia mekanismeja vastaan.
Tässä tutkimuksessa rekombinantit eukaryoottiekspressioplasmidit pcDNA3.1(+)-alfa-2-giardiini ja pcDNA3.1(+)-alfa-7.3-giardiini transfektoitiin hiiren primaarisiin peritoneaalisiin makrofageihin isäntä-NLRP3:n aktivoimiseksi.Tulehdukselliset kohteet seulottiin sitten.Arvioimme myös NLRP3-inflammasomin roolia G. duodenalis -bakteerin patogeenisyydessä, tutkimme, indusoivatko alfa-2- ja alfa-7,3-giardiinit NLRP3-tulehduskipua in vivo, ja määritimme, että nämä kaksi giardiinien roolia giardiinien patogeenisyydessä G. duodenalis.Yhteisenä tavoitteenamme oli kehittää lupaavia kohteita G. duodenalis -infektion ehkäisyyn.
Villityypin (WT) C57BL/6 5–8 viikon ikäiset naarashiiret ostettiin Liaoning Changsheng Experimental Animal Centeristä (Liaoning, Kiina).Hiirillä oli vapaa pääsy veteen, he saivat steriloitua ruokaa ja niitä pidettiin 12/12 tunnin valo/pimeä-syklissä.Ennen tartuntaa hiiret saivat antibiootteja ad libitum juomavedessä, johon oli lisätty ampisilliinia (1 mg/ml), vankomysiiniä (1 mg/ml) ja neomysiiniä (1,4 mg/ml) (kaikki ostettu Shanghaista, Kiinasta, keinotekoiset organismit) [22 ].].Hiiret, jotka menettivät kykynsä syödä ja juoda yli 24 tunniksi ja menettivät ≥ 20 % ruumiinpainosta, lopetettiin inhimillisesti kohdunkaulan dislokaatiolla.
WB G. duodenalis -trofhozoiitteja (American Type Culture Collection, Manassas, USA) täydennettiin 12,5 %:lla naudan sikiön seerumia (FBS; Every Green, Zhejiang, Kiina) ja 0,1 %:lla naudan sappia (Sigma-Aldrich, St. Missouri, USA) ).USA) mikroaerobisissa olosuhteissa.Konfluentit trofosoiitit kerättiin jäille ja siirrostettiin suhteessa 1:4 lisä lisääntymistä varten.
Giardia pohjukaissuolen kystat indusoitiin aiemmin kuvatulla tavalla [23], trofosoiitit kerättiin logaritmisessa faasissa ja laimennettiin sitten kapselointia indusoivalla elatusaineella, pH 7,1 (modifioitu TYI-S-33) lopulliseen konsentraatioon 1 × 106 trofozoiittia/ml.sappipitoisuus 0,05 % elatusaine).Trofosoiitteja viljeltiin anaerobisissa olosuhteissa 37 °C:ssa logaritmiseen kasvuvaiheeseen asti.Vaihda elatusaine kystoja indusoivaan elatusaineeseen (pH 7,8; ​​modifioitu TYI-S-33-elatusaine, jossa on 1 % sappipitoisuus) ja viljele G. duodenalis 37°C:ssa 48–96 tuntia, jonka aikana kystien muodostumista tarkkailtiin mikroskoopilla.Kun suurin osa trofosoiiteista oli indusoitu muodostamaan kystoja, viljelyseos otettiin talteen ja suspendoitiin uudelleen steriiliin deionisoituun veteen jäljellä olevien trofosoiitien hajottamiseksi.Kystat laskettiin ja säilytettiin 4 °C:ssa myöhempiä analyysejä varten mahaletkun läpi hiirillä.
Giardian ekstrasellulaariset vesikkelit (GEV:t) rikastettiin aiemmin kuvatulla tavalla [13].Logaritmisessa kasvuvaiheessa olevat trophozoiitit suspendoitiin uudelleen modifioituun TYI-S-33-elatusaineeseen, joka oli valmistettu eksosomeista poistettuun FBS:ään (Biological Industries, Beit-Haemek, Israel) lopulliseen konsentraatioon 1 x 106 loista/ml ja inkuboitiin 12 tuntia.eristettiin viljelmän supernatantista sentrifugoimalla 2 000 g 10 minuutin ajan, 10 000 g 45 minuutin ajan ja 100 000 g 60 minuutin ajan.Sakat liuotettiin fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS), kvantifioitiin käyttämällä BCA-proteiinin määrityspakkausta (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ja säilytettiin -80 °C:ssa tai käytettiin suoraan lisäanalyyseihin.
Primaariset hiiren vatsakalvon makrofagit valmistettiin aiemmin kuvatulla tavalla [24].Lyhyesti sanottuna hiirille (iältään 6-8 viikkoa) injektoitiin (intraperitoneaalisesti [ip]) 2,5 ml:lla 2,98 % Difco-nestemäistä tioglykoliväliainetta (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) ja niille syötettiin 3-4 kitalausta.Makrofagien suspensio otettiin talteen hiirten vatsaontelosta eutanasian jälkeen ja sentrifugoitiin 3 kertaa 1000 g:ssä 10 minuutin ajan.Kerätyt solut havaittiin virtaussytometrialla käyttäen CD11b-markkeria, kunnes solujen puhtaus oli > 98 %, sitten lisättiin 6-kuoppaisille soluviljelylevyille (4,5 x 106 solua/kuoppa) ja inkuboitiin 10 % FBS:n (Bioindustry) kanssa 37 °C:ssa.ja 5 % CO2.
RNA uutettiin 1 x 107 trofosoiitista 1 ml:ssa TRIzol-reagenssia (Vazyme, Nanjing, Kiina), genominen DNA uutettiin G. duodenalisin kokonais-RNA:sta käyttämällä MonScript dsDNasea (Monad, Wuhan, Kiina) ja syntetisoitiin komplementaarinen DNA (cDNA) käyttämällä MonScript RTIIII Super Mixiä (Monad) valmistajan ohjeiden mukaisesti.
Kohde-G. duodenalis -geenin CDS-sekvenssitiedot saatiin NCBI GenBankista.Käytä Primer 5.0:aa erityisten saumattomien kloonausalukkeiden suunnitteluun kullekin kohdegeenille.Eteenpäin oleva aluke (5'-3') koostuu kolmesta osasta: päällekkäisestä sekvenssistä linearisoidun vektorin pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) kanssa ja aloituskodoneista ATG ja GNN (jos ensimmäinen emäs ei ole G).Tämä tehdään ilmaisun tehokkuuden parantamiseksi.Lisäksi vähintään 16 bp yhdistettyjä emäksiä (GC-pitoisuus 40–60 %/Tm n. 55 °C).Käänteinen aluke (5'-3') koostuu kahdesta osasta, päällekkäisestä sekvenssistä EcoRV-linearisoidun vektorin pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) kanssa ja vähintään 16 bp:n yhdistetystä emäksestä.(lukuun ottamatta kahta viimeistä pysäkkiä).emäkset) kodoni, kuten AA tai GA, jotta rekombinanttiplasmidit voivat ilmentää leimattuja proteiinejaan).Alukesekvenssit on lueteltu taulukossa 1, ja ne syntetisoi Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, Kiina).
Kohteet monistettiin käyttämällä Pfu-DNA-polymeraasia (Tiangen, Peking, Kiina) tai Ex-taq:ia (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Peking, Kiina) käyttämällä valmistettua G. duodenalis cDNA:ta templaattina.Eukaryoottinen ilmentämisvektoriplasmidi pcDNA3.1(+) linearisoitiin restriktioentsyymillä EcoRV ja defosforyloitiin käyttämällä Fast AP:tä (Thermo Fisher Scientific).Linearisoidut pcDNA3.1(+)-fragmentit ja monistetut kohdegeenifragmentit puhdistettiin käyttämällä DNA-geelipuhdistuspakkausta (Tiangen) ja kvantifioitiin käyttämällä Nanodrop ND-2000:ta (Thermo Fisher Scientific).pcDNA3.1(+)-fragmentti ja kukin kohdegeenifragmentti yhdistettiin uudelleen käyttämällä MonClone-yksikokoonpanokloonausseosta (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, Kiina) ja varmistettiin DNA-sekvensoinnilla käyttämällä Comate Bioscience Company Limitediä (Changchun, Kiina)..
Endotoksiinittomat plasmidit pcDNA3.1(+)-alpha-2 ja pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 luotiin käyttämällä SanPrep Endotoxin-free Plasmid Mini Kit -sarjaa (Sangon Biotech).Konsentraatio pidettiin yli 500 ng/ul sen varmistamiseksi, että eluointipuskurissa oleva EDTA ei häirinnyt transfektiomääritystä.Primäärisiä hiiren vatsakalvon makrofageja viljeltiin 6-kuoppaisilla levyillä täydellisellä RPMI 1640 -elatusaineella (Biological Industries) 12 tuntia, sitten solut pestiin 3 kertaa lämpimässä PBS:ssä penisilliinin ja streptomysiinin poistamiseksi ja sitten alustassa, jota oli täydennetty täydellisellä alustalla.Endotoksiinittomat plasmidit pcDNA3.1(+)-alpha-2 ja pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (2,5 µg) laimennettiin 125 µl:aan Opti-MEM-pelkistettyä seerumiväliainetta (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..Sitten 5 ui Lipofectamine 2000 -transfektioreagenssia (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) laimennettiin 125 ul:aan alhaisen seerumin Opti-MEM-alustaa.Valmista liposomi-DNA-kompleksit sekoittamalla laimennettu endotoksiiniton plasmidi Lipofectamine 2000:n kanssa ja antamalla seoksen seistä huoneenlämpötilassa 5 minuuttia.Siirrä kompleksit erikseen kunkin kuopan soluihin ja sekoita hitaasti.4 tunnin kuluttua soluviljelyväliaine korvattiin 2 ml:lla täydellistä RPMI 1640 -elatusainetta ja viljelyä jatkettiin 24 tuntia.Soluihin lisättiin tuoretta soluviljelyalustaa ja inkuboitiin eri ajankohtina määrityksen suunnittelusta riippuen.
Proteiininäytteet supernatanteista ja solulysaateista valmistettiin aiemmin kuvatulla tavalla [25].Kalvonsiirtoparametrit pro-IL-1β:lle, pro-kaspaasi-1:lle, kaspaasi-1 p20:lle, NLRP3:lle, p-aktiinille ja His-tagille olivat 200 mA/90 min.Interleukiini 1β:lle (IL-1β; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA), kaspaasi-1:lle (p20) (Adipogen, Sveitsi) ja NLRP3:lle (Adipogen SA, Epalinges, Sveitsi) ja 1:5000:lle, joka kohdistuu His tagiin (Amylet Scientific) Wuhan, Kiina) ja β-aktiini (Proteintech, Wuhan, Kiina).
Silloittaminen disukkinimidisuberaatilla (DSS) suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla [26].Solut pestiin 3 kertaa kylmällä PBS:llä ja hajotettiin täydellisesti 27 gaugen neulalla 50 ul:ssa ASC-reaktiopuskuria (pH 8,0), joka sisälsi 25 mM Na2P04, 187,5 mM NaCl, 25 mM HEPES ja 125 mM NaHC03.Seosta sentrifugoitiin 5 000 g:llä 3 minuuttia ja pelletti ommeltiin 10 ul:lla DSS:ää (25 mM DMSO:ssa) ja 40 ul:lla ASC-reaktiopuskuria 30 minuutin ajan 37 °C:ssa.Kun oli sentrifugoitu 5 000 g:llä 10 minuutin ajan, pelletti liuotettiin liuokseen, jossa oli 40 µl ASC-reaktiopuskuria ja 10 µl 6x proteiinilatauspuskuria (TransGen, Peking, Kiina), ja sitten liuos sammutettiin huoneenlämpötilassa 15 minuuttia. min., Keitä sitten 10 minuuttia.Proteiininäytteet altistettiin sitten Western blot -analyysille käyttämällä primaarisia anti-ASC-vasta-aineita (Wanleibio, Shenyang, Kiina) laimennussuhteella 1:500.
Aiemmin kuvatun menettelyn [13] mukaisesti soluviljelmän supernatantit kerättiin ja pro-inflammatorisen sytokiinin IL-1p eritys määritettiin käyttämällä hiiren IL-1 Beta ELISA -kittiä (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).Muunna OD450nm-arvot proteiinipitoisuuksiksi käyttämällä IL-1β-standardikäyrää.
Peitelasiin päällystetyt solut pestiin varovasti 3 kertaa lämpimässä PBS:ssä, kiinnitettiin kudossolukiinnitysaineeseen (Biosharp, Peking, Kiina) 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa (RT) 0,1 % Triton X-Permeabilize -liuoksessa 100 °C:ssa (laimennettu PBS:ään; Biosharp). ) 20 minuuttia huoneenlämpötilassa ja blokaa 5-prosenttisessa naudan seerumialbumiinissa (PBS:ssä) 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa.Sitten soluja inkuboitiin yön yli 4 °C:ssa primaaristen vasta-aineiden kanssa ASC:tä (1:100 laimennus) tai NLRP3:a (1:100 laimennus) vastaan ​​ja Cy3-leimattua vuohen anti-kanin IgG:tä (H+L) (1:400; EarthOx) vastaan. , San Francisco, CA, USA) tai FITC-konjugoitu vuohen anti-hiiri-IgG (1:400; Earthox) yön yli 37 °C:ssa pimeässä 1 tunnin ajan.Ytimet värjättiin Hoechst 33258:lla (10 µg/ml; UE, Suzhou, Kiina) 5 minuutin ajan ja tarkkailtiin fluoresenssimikroskoopilla (Olympus Corporation, Tokio, Japani).
Hiiret jaettiin neljään ryhmään (n = 7 kussakin ryhmässä): (i) PBS-käsitelty negatiivinen kontrolliryhmä (vain PBS; letkulla 100 ui/hiiri PBS:ää, mitä seurasi päivittäinen intraperitoneaalinen injektio 100 ui/hiiri PBS 3 tuntia myöhemmin)., yhtäjaksoisesti 7 päivän ajan);(ii) negatiivinen kontrolliryhmä, jota käsiteltiin MCC950-estäjällä [27] (100 ui/hiiri PBS-letkun kautta, 3 tuntia myöhemmin, 10 mg/kg ruumiinpainoa [BW] MCC950:tä [PBS:ssä] annettiin intraperitoneaalisesti päivittäin, kesto 7 päivää);(iii) G. duodenalis -kystainfektioryhmä (1,5 x 106 kystaa/hiiri letkuruokinnalla, 3 tuntia myöhemmin, 100 µl/hiiri PBS:ää vatsaontelonsisäisesti annettuna päivittäin 7 päivän ajan);(iv) G. duodenalis -kysta yhdistetty infektioryhmä MCC950-inhibiittorihoitoryhmä (1,5 x 106 kystaa/hiiri letkuruukun kautta, 10 mg/kg ruumiinpainoa MCC950 intraperitoneaalisesti päivittäin 7 päivän ajan 3 tunnin ajan).Jokaisen hiiren ruumiinpainoa seurattiin päivittäin ja kaikki hiiret lopetettiin 7. päivänä.Kerätty pohjukaissuoli (3 cm pitkä) leikattiin pieniksi paloiksi 1 ml:ssa PBS:ää, kystat tuhottiin yön yli PBS:ssä 4 °C:ssa ja G. duodenalis trophozoites.Tuore pohjukaissuoli (1 cm pitkä) eristettiin hematoksyliini- ja eosiinivärjäystä varten (H&E).
Hiiret jaettiin kahteen ryhmään: (i) MOCK-kontrolliryhmä ja (ii) MCC950-inhibiittoriryhmä.Kussakin ryhmässä oli viisi hoitoa (n = 7/hoitoryhmä): (i) PBS-käsittelyn negatiivinen kontrolliryhmä (vain PBS; 100 µl/hiiri PBS, intramuskulaarinen (IM) injektio (tibialis anterior) [28, 29] ;( ii) pcDNA3.1(+)-plasmidin negatiivinen kontrolliryhmä (100 ug/hiiri-DNA, lihaksensisäisellä injektiolla (iii) G. duodenalis -kystainfektion positiivinen kontrolliryhmä (1,5 x 106 kystaa/hiiri, letkun kautta) (iv) a); ryhmä, jota käsiteltiin plasmidilla pcDNA3.1(+)-alfa-2 (100 µg/hiiri DNA, lihaksensisäisellä injektiolla) ja (v) ryhmä, jota käsiteltiin plasmidilla pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (100 µg/hiiri) DNA:n jälkeen 12 tunnin siirron jälkeen MCC950-inhibiittoriryhmän hiiret saivat päivittäisen intraperitoneaalisen MCC950-injektion (10 mg/kg ruumiinpainoa) 7 päivän ajan, kun taas MOCK-ryhmän hiiret saivat saman määrän PBS-käsittelyä. Verinäytteet otettiin kerättiin silmämunahiiristä ja jätettiin yön yli 4 °C:seen. Seeruminäytteet eristettiin käyttämällä entsyymikytkettyä immunosorbenttimääritystä (ELISA) IL-1β-tasojen mittaamiseksi.
Kolmekymmentäviisi hiirtä jaettiin viiteen ryhmään (n = 7/ryhmä).Ryhmä 1 oli negatiivinen kontrolliryhmä, jota käsiteltiin PBS:llä: hiiret saivat 100 µl PBS:ää lihakseen ja 3 päivää myöhemmin letkuruokinnalla.Ryhmä 2 on positiivinen kontrolliryhmä, joka oli infektoitu G. duodenalis -kystailla: hiirille injektoitiin 100 µl PBS:ää ja 3 päivää myöhemmin 1,5 x 106 kystaa/hiiri injektoitiin mahansisäisesti.Kolmas ryhmä – plasmidi-immunisaatio pcDNA3.1(+):lla yhdessä pohjukaissuolen kystainfektion kontrolliryhmän kanssa: hiiret saivat 100 µg plasmidi-DNA:ta pcDNA3.1(+)(im) suun kautta, 1,5×106 kystaa/hiiri 3 useiden päivää.Ryhmät 4 ja 5 olivat rekombinantti-pcDNA3.1(+)-alfa-2-giardiiniplasmidi tai pcDNA3.1(+)-alfa-7.3-giardiiniplasmidi yhdessä G. duodenalis -kystainfektion kanssa.Koeryhmä: hiiret saivat 100 ug pcDNA3:a.1(+)-giardiiniplasmidi-DNA (im), sitten 3 päivää myöhemmin 1,5 x 106 kystaa/hiiri injektoitiin letkuruokinnalla.Kunkin hiiren ruumiinpainoa tarkkailtiin sen jälkeen, kun G. duodenalis -kysta oli viety putken läpi.Tuore pohjukaissuoli kerättiin loiskuormitusmittauksia ja HE-värjäysanalyysiä varten.
Histopatologiset muutokset analysoitiin aiemmin julkaistun menetelmän mukaisesti [30].Tuore pohjukaissuoli kiinnitettiin kudossolukiinnitysaineella, upotettiin parafiiniin, leikattiin 4 μm:n paloiksi, värjättiin H&E:llä ja analysoitiin valomikroskoopilla.Patologi, joka ei ollut tietoinen hoidosta, arvioi edustavat patologiset muutokset seitsemässä kudosleikkeessä seitsemästä riippumattomasta hiirestä, ja ne tallennettiin 200-kertaisella suurennuksella.Villien pituus ja kryptien syvyys mitattiin aiemmin kuvattujen menetelmien mukaisesti.
Tulokset in vitro ja in vivo saatiin kolmena rinnakkaisena.Kaaviot luotiin käyttämällä GraphPad Prism 7.00:aa (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).Kahden ryhmän väliset erot analysoitiin t-testillä, kun taas erot ≥3 ryhmän välillä analysoitiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA) käyttämällä SPSS-ohjelmistoa (versio 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, USA).Data analysoitiin varianssin homogeenisuuden suhteen käyttämällä Levene-testiä ja sen jälkeen Bonferronin post hoc -testiä (B).Merkittävyys ilmaistaan ​​muotoina P < 0,05, P < 0,01 ja P < 0,001 (ei merkitsevä [ns]) (P > 0,05).
Aikaisempi analyysimme GEV-proteomiikasta Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) -julkaisussa osoitti, että monet kohteet voivat olla osallisena tulehduksellisten signalointireittien aktivoinnissa [13].Valitsimme kaksi lupaavaa kohdetta, alfa-2- ja alfa-7.3-giardiinit, monisimme nämä molekyylit ja käytämme niitä pcDNA3.1(+)-eukaryoottisen ilmentymisvektorin rakentamiseen.Sekvensoinnin jälkeen rekombinantit pcDNA3.1(+)-alfa-2- ja alfa-7.3-giardiiniekspressioplasmidit transfektoitiin hiiren primaarisiin vatsakalvon makrofageihin, ja tulehduksen kaspaasi-1 p20 -signature-proteiini (aktivoidun kaspaasi-1:n fragmentti) tunnistettiin. selventää avainmolekyylejä, jotka voivat laukaista tulehduksen.Tulokset osoittivat, että alfa-2- ja alfa-7.3-giardiinit voivat indusoida p20-kaspaasi-1-ekspression, joka on samanlainen kuin GEV.Käsittelemättömässä negatiivisessa kontrollissa (vain PBS) ja plasmidikontrollissa pcDNA3.1(+) (kuvio 1) ei havaittu vaikutusta kaspaasi-1-aktivaatioon.
p20-kaspaasi-1-aktivaation mittaus pcDNA3.1(+)-alfa-2- ja alfa-7.3-giardiinien avulla.Rekombinantit eukaryoottiekspressioplasmidit pcDNA3.1(+)-alpha-2 ja alfa-7.3 giardiinit (kunkin kaistan yläpuolella) transfektoitiin hiiren primäärisiin peritoneaalisiin makrofageihin ja viljelmän supernatantit kerättiin 24 tuntia myöhemmin.Western blottausta käytettiin kaspaasi-1 p20 -tulehduksellisen proteiinin ilmentymistasojen mittaamiseen.Vain PBS-hoitoryhmää (kaista C) ja pcDNA3.1(+)-monoterapiaryhmää (pcDNA3.1-kaista) käytettiin negatiivisena kontrollina ja GEV-hoitoryhmää käytettiin positiivisena kontrollina.Rekombinanttiproteiinin ilmentyminen varmistettiin havaitsemalla histidiinimerkki kussakin proteiinissa, ja odotetut proteiinivyöhykkeet olivat alfa-2-giardiini (38,2 kDa) ja alfa-7,3-giardiini (37,2 kDa).GEV, Giardia duodenumin ekstrasellulaariset vesikkelit, pcDNA3.1(+), EcoRV-linearisoitu vektori, SUP, supernatantti
Sen määrittämiseksi, indusoivatko alfa-2-giardiini ja alfa-7.3-giardiini p20-kaspaasi-1:n ilmentymistä ja onko sillä roolia isännän NLRP3-tulehdusvasteen aktivoinnissa, pcDNA3.1(+)-alfa-2-giardiini ja pcDNA3.1(+)-alfa -7,3 giardiini transfektoitiin primaarisiin hiiren vatsakalvon makrofageihin rekombinanttiplasmidi-DNA:lla, ja tärkeimpien tulehdusproteiinien NLRP3 ilmentymistasot, lokalisaatio ja oligomerisaatio määritettiin.Tässä kokeessa GEV:tä käytettiin positiivisena kontrolliryhmänä, ja ei-käsittelyä saanut ryhmä (vain PBS) tai pcDNA3.1(+)-transfektiokäsittelyryhmä oli negatiivinen ryhmä.Tulokset osoittivat, että kuten GEV-ryhmässä, giardiinin pcDNA3.1(+)-alpha-2:n ja giardiinin pcDNA3.1(+)-alpha-7.3:n rekombinanttiplasmidi-DNA johti NLRP3:n, pro-IL-1β:n ja prokaspaasi-1- ja kaspaasi-1-aktivaatio (kuvio 2a).Lisäksi molemmat giardiinit indusoivat merkittävää IL-1β-eritystä (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,1000; alfa-2-giardiini: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0007 ).;alfa-7,3-giardiini: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P < 0,0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0047) (kuvio 2b).Useimmat ASC-proteiinit olivat monomeerisiä ei-hoitoa saaneessa ryhmässä tai hoitoryhmässä, joka oli transfektoitu pcDNA3.1(+)-plasmidilla, toisin kuin pcDNA3.1(+)-alpha-2 tai pcDNA3.1(+)-alpha- 7.3 giardiini.ASC-oligomerisaatio tapahtui GEV-positiivisen kontrolliryhmän tai -ryhmän rekombinanttiplasmidi-DNA:ssa, mikä osoitti oligomeerisen muodon (kuvio 2c).Nämä alustavat tiedot viittaavat siihen, että alfa-2-giardiini ja alfa-7,3-giardiini voivat indusoida NLRP3-tulehdusaktivaation.Myöhemmät immunofluoresenssitutkimukset ASC:n ja NLRP3:n lokalisoinnista osoittivat, että negatiivisessa kontrolliryhmässä ASC-proteiini oli hajallaan kaikkialla sytoplasmassa ja ilmaantui pistesignaalina stimuloitaessa pcDNA3.1(+)-alfa-2:ta giardiinilla tai pcDNA3:lla.1(+)-alfa-7,3-giardiiniryhmä tai GEV-positiivinen kontrolliryhmä (kuvio 2d).Negatiivisessa kontrollissa ja plasmidilla käsitellyissä pcDNA 3.1 -ryhmissä NLRP3-proteiinisignaalia ei havaittu, kun taas fluoresoiva signaalipiste oli vasteena pcDNA3.1(+)-alfa-2-giardiinille tai pcDNA3.1(+)-alpha-7.3:lle. havaittiin..giardiinia löytyy sytoplasmasta tai HEV:n stimulaation jälkeen (kuvio 2e).Nämä tiedot osoittavat edelleen, että G. duodenalis giardin alfa-2 ja giardin alfa-7.3 aktivoivat NLRP3-inflammasomin hiiren primaarisissa peritoneaalisissa makrofageissa.
pcDNA3.1(+)-alfa-2-giardiini ja pcDNA3.1(+)-alfa-7.3-giardiini aktivoivat NLRP3-tulehduksen hiiren peritoneaalisissa makrofageissa.Transfektoi rekombinantit eukaryoottiekspressioplasmidit pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin ja pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin primaarisiin hiiren vatsakalvon makrofageihin ja soluihin tai kerää supernatantti 24 tunnin kuluessa ilmentymisen analysointia, oligomerointia varten , eritystä.ja keskeisten tulehdusproteiinien lokalisointi.Negatiivisena kontrollina käytettiin vain PBS:ää (C) saavaa ryhmää ja pcDNA3.1(+) yksittäiskäsittelyryhmää ja positiivisena ryhmänä GEV-käsittelyryhmää.Tärkeimmät tulehdukselliset proteiinit NLRP3, mukaan lukien NLRP3, pro-IL-1β, pro-kaspaasi-1 ja p20-kaspaasi-1, havaittiin Western blot -menetelmällä.b IL-1p:n erittymistasot supernatanteissa määritettiin käyttämällä entsyymi-immunosorbenttimääritystä (ELISA).Kontrolli- ja koeryhmien väliset erot analysoitiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA) käyttäen SPSS-ohjelmistoversiota 22.0.Tähdet osoittavat merkittäviä eroja ryhmien välillä **P<0,01 ja ***P<0,001.c ASC-oligomerisaatiotasot pelleteissä määritettiin DSS-silloitusanalyysillä, kun taas ASC-tasoja solulysaateissa käytettiin latauskontrollina.d ISC-paikantamisen visualisointi immunofluoresenssilla.e Immunofluoresenssia käytettiin visualisoimaan NLRP3:n sijainti.ASC, apoptoottinen pilkkumainen proteiini;IL, interleukiini;NLRP3, nukleotideja sitova oligomerisaation kaltainen reseptori 3;ns, ei merkitsevä (P > 0,05)
Sekä G. duodenalis että sen erittämät GEV:t aktivoivat NLRP3-tulehduksen ja säätelevät isännän tulehdusvasteita in vitro.Näin ollen NLRP3-tulehduksen rooli G. duodenalis -bakteerin patogeenisyydessä on edelleen epäselvä.Tämän ongelman tutkimiseksi suunnittelimme kokeen G. duodenalis -kystalla infektoituneiden hiirten ja G. duodenalis -kystalla infektoituneiden hiirten + MCC950-inhibiittorikäsittelyllä ja vertailimme NLRP3-tulehdusekspressiota G. duodenalis -kystalla infektoituneena.Kokeen yksityiskohtainen kaavio on esitetty kuviossa 3a.Muutoksia hiirten ruumiinpainossa eri hoitoryhmissä tarkkailtiin 7 päivän ajan kystainfektion jälkeen, ja tulokset esitetään kuviossa 3b.Verrattuna puhtaalla PBS:llä käsiteltyyn ryhmään tulokset osoittivat, että (i) G. duodenalis -kystalla infektoituneiden hiirten ruumiinpaino laski päivästä 3 päivään 7 infektion jälkeen;(ii) käsittelyllä MCC950-inhibiittorilla ei ollut merkittävää vaikutusta hiirten ruumiinpainoon..Yksittäiseen infektioryhmään verrattuna MCC950:llä hoidetun pohjukaissuolen infektioryhmän paino laski eriasteisesti (päivä 1: ANOVA, F(3, 24) = 1,885, P = 0,0148; päivä 2: ANOVA, F( 3, 24) ) = 0,4602, P < 0,0001, päivä 3: ANOVA, F(3, 24) = 0,8360, P = 0,0010: ANOVA, F(3, 24) = 1,683, P = 0,0052, FANO; (3, 24) = 0,6497, P = 0,0645, päivä 6: ANOVA, F(3, 24) = 5,457, P = 0,0175, päivä 7: ANOVA, F(3, 24) = 2,893, P = 0,0202.Nämä tiedot osoittavat, että NLRP3-tulehdus suojaa hiiriä merkittävältä painonpudotukselta pohjukaissuolen infektion alkuvaiheissa (2-4 päivää).Tämän jälkeen pyrimme havaitsemaan G. duodenalis trofhozoiitteja pohjukaissuolen huuhtelunesteestä ja tulokset on esitetty kuvassa 3c.Verrattuna G. duodenalis -kystainfektioryhmään, trofosoiittien määrä pohjukaissuolessa lisääntyi merkittävästi NLRP3-tulehduksen salpauksen jälkeen (t(12) = 2,902, P = 0,0133).Pohjukaissuolen kudokset, jotka on värjätty HE:llä, osoittivat verrattuna negatiiviseen kontrolliin, jota käsiteltiin pelkästään PBS:llä ja MCC950:llä: (i) G. duodenalis -kystainfektio johti pohjukaissuolen villivaurioon (ANOVA, F(3, 24) = 0,4903, P = 0,0488 ) ja kryptatrofia (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(ii) pohjukaissuoli hiiristä, jotka on infektoitu G. duodenalis -kystailla ja joita on käsitelty MCC950-estäjillä.pohjukaissuolen villit olivat vaurioituneet ja kuolleet (ANOVA, F(3, 24) = 0,4903, P = 0,0144) ja atrofia ja kryptan haarautuminen (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0, 0481) (Kuva 3d- f) .Nämä tulokset viittaavat siihen, että NLRP3-inflammasomilla on rooli G. duodenalis -bakteerin patogeenisyyden vähentämisessä.
NLRP3-tulehduksen rooli Giardia pohjukaissuolen infektiossa.Hiirille annettiin letku (iv) duodenokokkikystat ja sitten niitä käsiteltiin MCC950:llä tai ilman sitä (ip).Kontrollina käytettiin yksittäisiä käsittelyryhmiä PBS:llä tai MCC950:llä.Kokeellinen ryhmä ja hoito-ohjelma.b Hiirten ruumiinpainoa kussakin eri hoitoryhmässä tarkkailtiin 7 päivän ajan.Ero G. duodenalis -infektioryhmän ja G. duodenalis + MCC950 -infektion hoitoryhmän välillä analysoitiin t-testillä käyttäen SPSS-ohjelmistoversiota 22.0.Tähdet osoittavat merkittäviä eroja kohdissa *P<0,05, **P<0,01 tai ***P<0,001.c Parasiittikuorma määritettiin laskemalla pohjukaissuolen huuhtelunesteessä olevien trofosoiittien lukumäärä.Ero G. duodenalis -infektioryhmän ja G. duodenalis + MCC950 -infektion hoitoryhmän välillä analysoitiin t-testillä käyttäen SPSS-ohjelmistoversiota 22.0.Tähdet osoittavat merkittäviä eroja, kun *P < 0,05.d Pohjukaissuolen histopatologian hematoksyliini- ja eosiinivärjäystulokset (H&E).Punaiset nuolet osoittavat vaurioita villissä, vihreät nuolet osoittavat vaurioita kryptoissa.Mittakaava: 100 µm.e, f Pohjukaissuolen ja hiiren kryptan korkeuden tilastollinen analyysi.Tähdet osoittavat merkittäviä eroja kohdissa *P<0,05 ja **P<0,01.Tulokset on otettu 7 riippumattomasta biologisesta kokeesta.BW, ruumiinpaino;ig, mahalaukunsisäinen annostelureitti;ip, intraperitoneaalinen annostelureitti;ns, ei merkitsevä (P > 0,05);PBS, fosfaattipuskuroitu suolaliuos;WT, villityyppi
IL-1β:n eritys on tulehduksen aktivoitumisen tunnusmerkki.Sen määrittämiseksi, aktivoivatko G. duodenalis alfa-2-giardiini ja alfa-7.3-giardiini NLRP3-isäntätulehduksen in vivo, käytimme hoitamattomia WT-hiiriä (huijausryhmä) ja NLRP3-tulehduksellisia hiiriä (MCC950-inhiboitu hoitoryhmä).Kokeen yksityiskohtainen kaavio on esitetty kuviossa 4a.Koeryhmät koostuivat hiiristä, joita oli käsitelty PBS:llä, G. duodenalis -kystakäsittelyllä letkuruokinnalla, pcDNA3.1:n lihaksensisäisellä injektiolla ja pcDNA3.1(+)-alfa-2-giardiinin tai pcDNA3.1-alfa-7.3-giardiinin intramuskulaarisella injektiolla.Seitsemäntenä päivänä rekombinanttiplasmidin lihaksensisäisen annon jälkeen seerumi kerättiin ja IL-ip:n taso kussakin ryhmässä määritettiin.Kuten kuvasta 4b näkyy, MOCK-ryhmässä: (i) PBS-ryhmään verrattuna pcDNA3.1-hoidolla ei ollut merkittävää vaikutusta IL-1β:n eritykseen (ANOVA, F(4,29) = 4,062, P = 0,9998), mutta IL-p-eritys oli merkittävästi kohonnut G. duodenalis -kystaryhmässä (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0002), (ii) pcDNA3.1-alfa-2-giardiini ja pcDNA3.1 - Alfa-7.3-giardiinin lihaksensisäinen injektio lisäsi merkitsevästi seerumin IL-1p-tasoja (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P < 0,0001);(iii) pcDNA3.1-alfa-7,3-giardiini aiheutti korkeat IL-1β-erityksen tasot pcDNA3.1-alfa-2-giardiinin lihakseen injektioryhmässä (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0333) .Verrattuna kuhunkin ryhmään MCC950-hoitoryhmässä ja MOCK-ryhmässä: (i) IL-1β-eritystasot PBS-kontrolliryhmässä ja pcDNA3.1-vertailuryhmässä laskivat jossain määrin MCC950-estäjän salpauksen jälkeen, mutta ero ei ollut merkitsevä (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,4912 pcDNA3,1: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,5949);(ii) MCC950:n estämisen jälkeen.IL-1β:n eritys väheni merkittävästi G. duodenalis -kysta-infektoituneessa ryhmässä, pcDNA3.1-alfa-2-giardiiniryhmässä ja pcDNA3.1-alfa-7.3-giardiiniryhmässä (G. duodenalis: ANOVA, F(9). 58) = 3,540, P = 0,0120 pcDNA3,1-alfa-2-giardiini: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,0447 pcDNA3,1-alfa-7,3 giardiini (9, ANOVA5, 8); ) = 3,540, P = 0,0164).Nämä tulokset viittaavat siihen, että alfa-2-giardiini ja alfa-7.3-giardiini välittävät NLRP3-inflammatorisen aktivoitumisen in vivo.
pcDNA3.1(+)-giardiinit aktivoivat NLRP3-isäntätulehduksen in vivo.Hiiret immunisoitiin (IM) rekombinantilla eukaryoottiekspressioplasmidilla pcDNA3.1(+)-alfa-2-giardiini tai pcDNA3.1(+)-alfa-7.3-giardiini ja sitten niitä käsiteltiin MCC950:llä (ip; MCC950-ryhmä) tai ei (valeryhmä). ).PBS- tai pcDNA3.1(+)-plasmidikäsittelyryhmää käytettiin negatiivisena kontrollina, G. duodenalis -kystakäsittelyryhmää käytettiin positiivisena kontrollina.Kokeellinen ryhmä ja hoito-ohjelma.b IL-1p:n seerumitasot hiirissä mitattiin päivänä 7 ELISA-määrityksellä.MOCK-ryhmän ryhmien väliset erot analysoitiin käyttämällä yksisuuntaista ANOVA:ta, ja erot MOCK-ryhmän ja MCC950-ryhmän välillä analysoitiin käyttämällä SPSS-ohjelmistoversion 22.0 t-testiä.Tähdet osoittavat merkittäviä eroja hoitoryhmien välillä MOCK-ryhmässä, *P<0,05 ja ***P<0,001;dollarimerkit ($) osoittavat merkittäviä eroja kunkin ryhmän välillä MOCK-ryhmässä ja MCC950-ryhmässä P < 0,05.Seitsemän itsenäisen biologisen kokeen tulokset.i, lihaksensisäinen injektio, ns, ei merkitsevä (P > 0,05)
Tutkiaksemme alfa-2- ja alfa-7.3-giardiinivälitteisen NLRP3-isäntätulehdusaktivaation vaikutusta G. duodenalis -tartunnalle, käytimme WT C57BL/6 -hiiriä ja injektoimme alfa-2-giardiinia ja alfa-7,3-giardiinia.plasmidi injektoitiin lihakseen 3 päivän kuluttua G. duodenalis -kystan mahaletkun läpi, minkä jälkeen hiiriä tarkkailtiin 7 päivän ajan.Kokeen yksityiskohtainen kaavio on esitetty kuviossa 5a.Jokaisen hiiren ruumiinpaino mitattiin joka päivä, näytteet tuoreesta pohjukaissuolihaudoksesta kerättiin 7. päivänä mahaletkun kautta antamisen jälkeen, trofosoiittien lukumäärä mitattiin ja histopatologisia muutoksia havaittiin.Kuten kuviosta 5b esitetään, ruokintaajan pidentyessä kunkin ryhmän hiirten paino kasvoi vähitellen.Hiirten MT alkoi laskea 3. päivänä G. duodenalis -kystien mahalaukunsisäisen annon jälkeen ja nousi sitten vähitellen.Alfa-2-giardiinin ja alfa7.3-giardiinin lihaksensisäisellä injektiolla indusoitunut NLRP3-inflammatorinen aktivaatio heikensi merkittävästi painonpudotusta hiirillä (päivä 1: pcDNA3.1-alfa-2-giardiini, ANOVA, F(4, 30) = 1,399, P = 0,9754 Päivä 1: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardiini, ANOVA, F(4,30)=1.399, P=0.9987 Päivä 2: pcDNA3.1-alfa-2-giardiini, ANOVA, F(4,30) = 0,3172, P = 0,9979, päivä 2: pcDNA3,1-alfa-7,3 giardiini, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,8409: pcDNA3,1-alfa-2 ANOVA, F,; 4, 30) = 0,8222, P = 0,0262 Päivä 3: pcDNA3.1-alfa-7,3-giardiini, ANOVA, F(4,30) = 0,8222, P = 0,0083, päivä 4: pcDNA3.1-alfa-2VA-giardiini; , F(4, 30) = 0,5620, P = 0,0012, päivä 4: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardiini, ANOVA, F(4, 30) = 0,5620, P < 0,0001, päivä 5: pcDNA3.1-alpha 2 giardiinia, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Päivä 5: pcDNA3.1-alfa -7,3 giardiini, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Päivä 6: .1 -DNA alfa-2-giardiini, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0012, päivä 6: pcDNA3.1-alfa-7,3 giardiini, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0006;Päivä 7: pcDNA3.1-alfa-2 giardiini, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P < 0,0001 Päivä 7: pcDNA3.1-alfa-7,3 giardiini, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P <0,0001).Parasiittikuorma arvioitiin pohjukaissuolessa (kuvio 5c).Verrattuna käsittelemättömään positiiviseen kontrolliin ja tyhjällä pcDNA3.1-vektorilla injektoituun ryhmään G. duodenalis -trofhozoiittien määrä väheni merkittävästi ryhmissä, joille injektoitiin α-2-giardiinia ja α-7,3-giardiinia (pcDNA3.1-alfa) -2 giardiini: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0002, pcDNA3.1-alfa-7,3 giardiini: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P < 0,0001).Lisäksi giardiini alfa-7,3 oli suojaavampi hiirillä kuin giardiini alfa-2 (ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0081).HE-värjäyksen tulokset on esitetty kuvassa.5d–f.Hiirillä, joihin oli injektoitu alfa-2-giardiinia ja alfa-7.3-giardiinia, oli vähemmän pohjukaissuolen kudosvaurioita, jotka ilmenivät villusvauriona, verrattuna hiiriin, joihin oli injektoitu G. duodenalis -bakteeria ja hiiriä, joihin oli injektoitu G. duodenalis -bakteeria yhdessä tyhjän pcDNA3-vektorin kanssa .1 Zoom.(pcDNA3.1-alfa-2-giardiini: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0035 tai P = 0,0068; pcDNA3.1-alfa-7,3 giardiini: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0028 tai P = 0,0055) ja vähentynyt kryptan atrofia (pcDNA3.1-alfa-2-giardiini: ANOVA, F(3, 24) = 1,470, P = 0,0264 tai P = 0,0158; pcDNA3.1-alfa-7,3 ANOVAgiardiini , F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 tai P = 0,0191).Nämä tulokset viittaavat siihen, että alfa-2-giardiini ja alfa-7,3-giardiini vähentävät G. duodenalis -bakteerin tarttuvuutta aktivoimalla NLRP3-inflammatorista in vivo.
pcDNA3.1(+)-giardiinien rooli G. duodenalis -infektiossa.Hiiret immunisoitiin (IM) rekombinanteilla eukaryoottiekspressioplasmideilla pcDNA3.1(+)-alfa-2-giardiini tai pcDNA3.1(+)-alfa-7.3-giardiini ja sitten altistettiin G. duodenalis -kysteille (ig).Negatiivisina kontrolliryhminä käytettiin PBS-ryhmää ja pcDNA3.1(+)+ -pohjukaissuolikystan hoitoryhmää ja positiivisena kontrolliryhmänä pohjukaissuolikystahoitoryhmää.Kokeellinen ryhmä ja hoito-ohjelma.b Hiirten MT:tä kussakin eri hoitoryhmässä tarkkailtiin 7 päivän ajan altistuksen jälkeen.Tähdet osoittavat merkittäviä eroja ryhmien välillä G. duodenalis -ryhmässä ja pcDNA3.1(+)-alfa-2-giardiiniryhmässä, *P < 0,05, **P < 0,01 ja ***P < 0,001;dollarimerkki ($) osoittaa merkittävän eron kunkin G. duodenalis -ryhmän ja pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 jardine-ryhmän välillä, $$P<0.01 ja $$$P<0.001.c Parasiittikuorma määritettiin laskemalla trofosoiittien lukumäärä 1 ml:ssa pohjukaissuolen huuhteluvettä (3 cm pitkä) ja ilmaistiin loisten lukumääränä pohjukaissuolen senttimetriä kohti.Erot G. duodenalis -infektioryhmän, pcDNA3.1(+)-alfa-2-giardiiniryhmän ja pcDNA3.1(+)-alfa-7.3-giardiiniryhmän välillä analysoitiin yksisuuntaisella ANOVA:lla käyttäen SPSS-ohjelmistoversiota 22.0.Tähdet osoittavat merkittäviä eroja arvoilla **P<0,01 ja ***P<0,001.d Histopatologiset muutokset pohjukaissuolessa.Punaiset nuolet osoittavat vaurioita villissä, vihreät nuolet osoittavat vaurioita kryptoissa.Mittakaava: 100 µm.e, f Hiiren pohjukaissuolen korkeuden (e) ja kryptan korkeuden (f) tilastollinen analyysi.Kuvan 1d ryhmien väliset erot analysoitiin yksisuuntaisella ANOVA:lla käyttäen SPSS-ohjelmistoversiota 22.0.Tähdet osoittavat merkittäviä eroja kohdissa *P<0,05 ja **P<0,01.Seitsemän itsenäisen biologisen kokeen tulokset.ns, ei merkitsevä (P > 0,05)
Giardia duodenum on ihmisten ja muiden nisäkkäiden tunnettu suolistoloinen, joka aiheuttaa giardiaasia.Vuonna 2004 se sisällytettiin WHO:n laiminlyötyjä sairauksia koskevaan aloitteeseen sen korkean esiintyvyyden vuoksi yli kuuden vuoden ajan, erityisesti yhteisöissä, joiden sosioekonominen asema on alhainen [32].Luontaisella immuunijärjestelmällä on kriittinen rooli immuunivasteessa G. duodenalis -infektiota vastaan.Hiiren makrofagien on raportoitu nielaisevan ja tappavan G. duodenalis -bakteeria vapauttamalla solunulkoisia ansoja [33].Aiemmat tutkimuksemme ovat osoittaneet, että G. duodenalis, ei-invasiivinen solunulkoinen loinen, aktivoi p38 MAPK:n, ERK:n, NF-kB p65:n ja NLRP3:n tulehdussignalointireittejä hiiren makrofageissa säätelemään isännän tulehdusvasteita, ja vapautunut GEV voi tehostaa tätä prosessia.13], 24].Kuitenkin tarkat PAMP:t, jotka osallistuvat NLRP3-tulehduksen säätelemään tulehdukseen GEV:ssä, ja NLRP3-tulehduksen rooli giardiaasissa on vielä selvittämättä.Valvoaksemme näitä kahta kysymystä teimme tämän tutkimuksen.
NLRP3-inflammasomi sijaitsee immuunisolujen sytoplasmassa, ja useat hiukkaset, kuten virtsahappokiteet, toksiinit, bakteerit, virukset ja loiset, voivat aktivoida sen.Bakteeritutkimuksissa toksiinit on tunnistettu tärkeimmiksi PAMP:eiksi, jotka aktivoivat tulehdusantureita, mikä johtaa tulehdukseen ja solukuolemaan [34].Jotkut rakenteellisesti erilaiset toksiinit, kuten hemolysiini Staphylococcus aureuksesta [35] ja Escherichia colista [36], hemolysiini BL (HBL) enterotoksiinista (NHE) [37], indusoivat NLRP3-tulehduksen aktivoitumista.Virustutkimukset ovat osoittaneet, että virulenssiproteiinit, kuten SARS-COV-2-vaippa (E) -proteiini [38] ja Zika-viruksen NS5-proteiini [39], ovat tärkeitä NLRP3-reseptorin tunnistamia PAMP:eja.Parasiittitutkimuksissa monien loisten on raportoitu liittyvän isännän tulehdusaktivaatioon, kuten Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41] ja Leishmania [42].Tiheät raeproteiinit GRA35, GRA42 ja GRA43, jotka liittyvät Toxoplasma gondiin virulenssiin, tarvitaan pyroptoosin induktioon Lewis-rotan makrofageissa [43].Lisäksi jotkin Leishmania-tutkimukset ovat keskittyneet yksittäisiin molekyyleihin, jotka osallistuvat NLRP3-inflammasomiin, kuten loisen kalvon lipofosfoglykaaniin [44] tai sinkkimetalloproteaasiin [45].Anneksiinin kaltaisen alfa-giardiinin geeniperheen joukossa alfa-1-giardiinin on osoitettu olevan mahdollinen rokoteehdokas, joka tarjoaa suojan G. duodenalis -bakteeria vastaan ​​hiirimallissa [18].Tutkimuksessamme valitsimme G. duodenalis -virulenssitekijät alfa-2 ja alfa-7,3 giardiinit, jotka ovat ainutlaatuisia giardialle, mutta joita on suhteellisen vähemmän raportoitu.Nämä kaksi kohdegeeniä kloonattiin pcDNA3.1(+)-eukaryoottisen ilmentämisjärjestelmän vektoriin tulehduksen aktivoitumisen analysoimiseksi.
Hiirimallissamme pilkotut kaspaasifragmentit toimivat tulehdusaktivaation markkereina.Stimulaatiossa NLRP3 on vuorovaikutuksessa ASC:n kanssa, värvää prokaspaaseja ja tuottaa aktiivisia kaspaaseja, jotka pilkkovat pro-IL-1β:n ja pro-IL-18:n kypsiksi IL-1β:ksi ja IL-18:ksi, vastaavasti -18.Tulehdukselliset kaspaasit (kaspaasit-1, -4, -5 ja -11) ovat säilynyt kysteiiniproteaasiperhe, jotka ovat kriittisiä synnynnäiselle puolustukselle ja osallistuvat tulehdukseen ja ohjelmoituun solukuolemaan [46].Kanoniset tulehdukset aktivoivat kaspaasi-1:n [47], kun taas kaspaasit-4, -5 ja -11 pilkkoutuvat epätyypillisten inflammasomien muodostumisen aikana [48].Tässä tutkimuksessa käytimme hiiren vatsakalvon makrofageja mallina ja tutkimme p20-kaspaasi-1:n pilkkomaa kaspaasi-1:tä isännän NLRP3-tulehdusaktivaation markkerina G. duodenalis -infektion tutkimuksissa.Tulokset osoittivat, että monet alfa-giardiinit ovat vastuussa tyypillisestä tulehduksen aktivoinnista, mikä on yhdenmukainen bakteereihin ja viruksiin liittyvien avainvirulenssimolekyylien löytämisen kanssa.Tutkimuksemme on kuitenkin vain alustava seulonta, ja on muitakin molekyylejä, jotka voivat aktivoida ei-klassisia inflammasomeja, sillä aikaisemmassa tutkimuksessamme havaittiin sekä klassisia että ei-klassisia inflammasomeja G. duodenalis -infektiossa [13].Sen määrittämiseksi edelleen, liittyykö muodostunut p20-kaspaasi-1 NLRP3-inflammasomiin, transfektoimme alfa-2- ja alfa-7.3-giardiinit hiiren vatsakalvon makrofageihin määrittääksemme tärkeimmät molekyyliproteiinin ilmentymistasot ja ASC-oligomerisaatiotasot, mikä vahvistaa, että molemmat a-giardiinit aktivoituvat. tulehduksellinen NLRP3.Tuloksemme eroavat hieman Manko-Prykhodan et al.:n tuloksista, jotka raportoivat, että Caco-2-solujen stimulointi pelkästään G. muris- tai E. coli EPEC-kannoilla voi lisätä NLRP3:n, ASC:n ja kaspaasi-1:n fluoresenssin intensiteettiä. vaikkakaan ei merkittävästi, mutta kuinka G. murisin ja E. colin kostimulaatio lisäsi kolmen proteiinin tasoja [49].Tämä ero voi johtua eroista Giardia-lajien, solulinjojen ja primäärisolujen valinnassa.Teimme myös in vivo -määrityksiä käyttämällä MCC950:tä 5 viikon ikäisillä naaraspuolisilla WT C57BL/6 -hiirillä, jotka ovat herkempiä G. duodenalis -bakteerille.MCC950 on tehokas ja selektiivinen pienimolekyylinen NLRP3-estäjä, joka estää kanonisen ja ei-kanonisen NLRP3-aktivaation nanomolaarisilla pitoisuuksilla.MCC950 estää NLRP3-aktivaatiota, mutta ei vaikuta AIM2-, NLRC4- ja NLRP1-tulehdusreittien tai TLR-signalointireittien aktivaatioon [27].MCC950 estää NLRP3:n aktivaation, mutta ei estä NLRP3:n alkamista, K+:n ulosvirtausta, Ca2+:n sisäänvirtausta tai NLRP3:n ja ASC:n välistä vuorovaikutusta;sen sijaan se estää NLRP3-tulehdusaktivaatiota estämällä ASC-oligomerisaation [27].Siksi käytimme MCC950:tä in vivo -tutkimuksessa määrittääksemme NLRP3-tulehduksen roolin giardiini-injektion jälkeen.Aktivoitu kaspaasi-1 p10 pilkkoo tulehdusta edistävät sytokiinit pro-IL-1β ja pro-IL-18 kypsiksi IL-1β:ksi ja IL-18:ksi [50].Tässä tutkimuksessa seerumin IL-1β-tasoja giardiinilla käsitellyissä hiirissä MCC950:n kanssa tai ilman sitä käytettiin indikaattorina siitä, oliko NLRP3-tulehdus aktivoitunut.Kuten odotettiin, MCC950-hoito alensi merkittävästi seerumin IL-1β-tasoja.Nämä tiedot osoittavat selvästi, että G. duodenalis giardiini alfa-2 ja giardiini alfa-7.3 pystyvät aktivoimaan hiiren NLRP3-tulehdusta.
Viime vuosikymmenen aikana kertynyt merkittävä tieto on osoittanut, että IL-17A on G. murista vastaan ​​​​vastaavan immuniteetin pääsäätelijä, joka indusoi IL-17RA-signalointia, tuottaa antimikrobisia peptidejä ja säätelee komplementin aktivaatiota [51].Giardia-infektiota esiintyy kuitenkin useammin nuorilla aikuisilla, ja on raportoitu, että Giardia-infektio nuorilla hiirillä ei aktivoi IL-17A-vastetta suojaamaan vaikutustaan ​​[52], mikä saa tutkijat etsimään muuta immunomoduloivaa Giardiaa.helminttiinfektion mekanismit.Äskettäisen tutkimuksen kirjoittajat raportoivat, että G. muris voi aktivoida NLRP3-tulehduksen E. coli EPEC:llä, mikä edistää antimikrobisten peptidien tuotantoa ja vähentää sen kiinnittymiskykyä ja trofosoiitien määrää suolistossa, mikä vähentää paksusuolen vakavuutta. basillien aiheuttamat sairaudet [49].NLRP3-tulehdus on osallisena eri sairauksien kehittymisessä.Tutkimukset ovat osoittaneet, että Pseudomonas aeruginosa laukaisee autofagian makrofageissa solukuoleman välttämiseksi, ja tämä prosessi riippuu NLRP3-tulehduksen aktivoinnista [53].N. caninumin kohdalla reaktiivisten happilajien välittämä NLRP3-tulehduksen aktivaatio rajoittaa sen replikaatiota isännässä, mikä tekee siitä mahdollisen terapeuttisen kohteen [9].Paracoccidioides brasiliensis -bakteerin on havaittu indusoivan NLRP3-inflammasomin aktivaatiota hiiren luuytimestä peräisin olevissa dendriittisoluissa, mikä johtaa tulehduksellisen sytokiinin IL-1β vapautumiseen, jolla on kriittinen rooli isännän puolustuksessa [10].Useat Leishmania-lajit, mukaan lukien L. amazonensis, L. major, L. braziliensis ja L. infantum chagasi, aktivoivat NLRP3:n ja ASC-riippuvaisen kaspaasi-1:n makrofageissa sekä Leishmania-infektion.Loisten replikaatio tehostuu hiirillä, joista puuttuu NLRP3/ASC/kaspaasi-1-geeni [11].Zamboni et ai.Leishmania-infektion on raportoitu indusoivan NLRP3-inflammasomin aktivaatiota makrofageissa, mikä rajoittaa solunsisäistä loisten replikaatiota.Siten Leishmania voi estää NLRP3-aktivaatiota välttämisstrategiana.In vivo -tutkimuksissa NLRP3-tulehdus vaikutti Leishmanian eliminaatioon, mutta ei vaikuttanut kudoksiin [54].Päinvastoin, helmintiaasitutkimuksissa NLRP3-inflammasomin aktivaatio tukahdutti isännän suojaavan immuniteetin maha-suolitulehdusta vastaan ​​[12].Shigella on yksi tärkeimmistä ripulia aiheuttavista bakteereista maailmanlaajuisesti.Nämä bakteerit voivat indusoida IL-1β:n tuotantoa P2X7-reseptorivälitteisen K+-virtauksen, reaktiivisten happilajien, lysosomaalisen happamoitumisen ja mitokondriovaurioiden kautta.NLRP3-tulehdus säätelee negatiivisesti makrofagien fagosytoosia ja bakterisidistä aktiivisuutta Shigellaa vastaan ​​[55].Plasmodiumtutkimukset ovat osoittaneet, että Plasmodiumilla infektoidut AIM2-, NLRP3- tai kaspaasi-1-puutteiset hiiret tuottavat suuria määriä tyypin 1 interferonia ja ovat vastustuskykyisempiä Plasmodium-infektiolle [56].Alfa-2-giardiinin ja alfa-7.3-giardiinin rooli NLRP3-tulehduksen patogeenisen aktivoitumisen indusoinnissa hiirillä on kuitenkin epäselvä.
Tässä tutkimuksessa NLRP3-tulehduksen esto MCC950:lla alensi painoa ja lisäsi trofosoiittien määrää suolen huuhtelunesteessä hiirillä, mikä johti vakavampiin patologisiin muutoksiin pohjukaissuolen kudoksessa.Alfa-2-giardiini ja alfa-7.3-giardiini aktivoivat isäntähiiren NLRP3-tulehduksen, lisäävät hiiren ruumiinpainoa, vähentävät trofosoiittien määrää suolen huuhtelunesteessä ja lievittävät patologisia pohjukaissuolen vaurioita.Nämä tulokset viittaavat siihen, että G. duodenalis voi aktivoida NLRP3-isäntätulehduksen alfa-2-giardiinin ja alfa-7,3-giardiinin kautta, mikä vähentää G. duodenalis -bakteerin patogeenisyyttä hiirissä.
Tuloksemme osoittavat yhdessä, että alfa-2- ja alfa-7.3-giardiinit indusoivat NLRP3-isäntätulehduksen aktivoitumista ja vähentävät G. duodenalis -bakteerin tarttuvuutta hiirissä.Siksi nämä molekyylit ovat lupaavia kohteita giardiaasin ehkäisyssä.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardiasis: yleiskatsaus.Äskettäin paljastettiin, että Pat Inflamm on allerginen huumeille.2019;13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: katsaus farmakoterapiaan.Proviisorin asiantuntijalausunto.2007;8: 1885–902.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.Giardiaasi, lääkeresistenssi ja uusien kohteiden löytäminen.Infektoi Disord-lääkekohteita.2010; 10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T jne. NLRP3 tulehdukselliset ja tulehdukselliset sairaudet.Oxide Med Cell Longev.2020; 2020: 4063562.
Chen GY, Núñez G. Inflammasomin rooli suoliston tulehduksessa ja syövässä.Gastroenterologia.2011;141:1986-99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Kanoninen ja epätyypillinen NLRP3-tulehdusaktivaatio immuunitoleranssin ja suoliston tulehduksen risteyksessä.esi-immuuni.2017; 8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S, et ai.ROS-välitteinen NLRP3-tulehdusaktivaatio on osallisena vasteena N. caninum -infektiolle.Loinen vektori.2020; 13:449.