Kiitos vierailustasi Nature.comissa.Käyttämässäsi selainversiossa on rajoitettu CSS-tuki.Parhaan kokemuksen saamiseksi suosittelemme käyttämään päivitettyä selainta (tai poistamaan Yhteensopivuustila käytöstä Internet Explorerissa).Sillä välin varmistaaksemme jatkuvan tuen hahmonnamme sivuston ilman tyylejä ja JavaScriptiä.
Toxoplasma gondii on solunsisäinen alkueläinloinen, joka moduloi tartunnan saaneen isännän mikroympäristöä ja jonka tiedetään liittyvän aivokasvaimen kasvuun.Tässä tutkimuksessa oletamme, että Toxoplasma-infektion eksosomaalinen miRNA-21 edistää aivokasvaimen kasvua.Eksosomit toksoplasmalla infektoituneesta BV2-mikrogliasta karakterisoitiin ja U87-glioomasolujen internalisaatio vahvistettiin.Eksosomaaliset mikroRNA-ilmentymisprofiilit analysoitiin käyttämällä Toxoplasma gondiiin ja kasvainten lajitteluun liittyviä mikroRNA- ja mikroRNA-21A-5p-ryhmiä.Tutkimme myös kasvaimeen liittyvien geenien mRNA-tasoja U87-glioomasoluissa muuttamalla miR-21-tasoja eksosomeissa ja eksosomien vaikutusta ihmisen U87-glioomasolujen lisääntymiseen.Toxoplasma gondii -tartunnan saaneiden U87-glioomasolujen eksosomeissa mikroRNA-21:n ilmentyminen lisääntyy ja kasvaintenvastaisten geenien (FoxO1, PTEN ja PDCD4) aktiivisuus vähenee.Toxoplasmalla infektoidut BV2-peräiset eksosomit indusoivat U87-glioomasolujen proliferaatiota.Eksosomit indusoivat U87-solujen kasvua hiiren kasvainmallissa.Ehdotamme, että lisääntynyt eksosomaalinen miR-21 toksoplasma-infektoituneessa BV2-mikrogliassa voi olla tärkeä rooli solujen kasvun edistäjänä U87-glioomasoluissa alentamalla kasvainten vastaisia ​​geenejä.
On arvioitu, että maailmanlaajuisesti vuonna 2018 diagnosoitiin yli 18,1 miljoonaa pitkälle edennyt syöpätapausta, joista noin 297 000 keskushermoston kasvainta (1,6 % kaikista kasvaimista)1.Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että ihmisen aivokasvainten kehittymisen riskitekijöitä ovat erilaiset kemialliset tuotteet, sukuhistoria ja pään terapeuttisten ja diagnostisten laitteiden ionisoiva säteily.Näiden pahanlaatuisten kasvainten tarkkaa syytä ei kuitenkaan tunneta.Noin 20 % kaikista maailman syövistä johtuu tartunta-aineista, mukaan lukien virukset, bakteerit ja loiset3,4.Tartunnan aiheuttavat patogeenit häiritsevät isäntäsolun geneettisiä mekanismeja, kuten DNA:n korjausta ja solusykliä, ja voivat johtaa krooniseen tulehdukseen ja immuunijärjestelmän vaurioitumiseen5.
Ihmisen syöpään liittyvät tartunnanaiheuttajat ovat yleisimmät viruspatogeenit, mukaan lukien ihmisen papilloomavirukset ja hepatiitti B- ja C-virukset.Loisilla voi myös olla mahdollinen rooli ihmisen syövän kehittymisessä.Useat loislajit, nimittäin Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis ja Hymenolepis nana, on liitetty erilaisiin ihmisen syöpiin 6,7,8.
Toxoplasma gondii on solunsisäinen alkueläin, joka säätelee infektoituneiden isäntäsolujen mikroympäristöä.Tämän loisen arvioidaan saastuttavan noin 30 % maailman väestöstä, mikä vaarantaa koko väestön9,10.Toxoplasma gondii voi tartuttaa elintärkeitä elimiä, mukaan lukien keskushermosto (CNS) ja aiheuttaa vakavia sairauksia, kuten kuolemaan johtavan aivokalvontulehduksen ja enkefaliitin, erityisesti immuunipuutteisilla potilailla9.Toxoplasma gondii voi kuitenkin myös muuttaa tartunnan saaneen isännän ympäristöä moduloimalla solujen kasvua ja immuunivasteita immunokompetenteilla yksilöillä, mikä johtaa oireettoman kroonisen infektion säilymiseen9,11.Mielenkiintoista on, että kun otetaan huomioon korrelaatio T. gondiin esiintyvyyden ja aivokasvainten esiintyvyyden välillä, jotkut raportit viittaavat siihen, että kroonisen T. gondii -infektion aiheuttamat isäntäympäristön muutokset in vivo muistuttavat kasvaimen mikroympäristöä.
Eksosomit tunnetaan solujen välisinä kommunikaattoreina, jotka toimittavat biologista sisältöä, mukaan lukien proteiineja ja nukleiinihappoja, naapurisoluista16,17.Eksosomit voivat vaikuttaa kasvaimeen liittyviin biologisiin prosesseihin, kuten anti-apoptoosiin, angiogeneesiin ja etäpesäkkeisiin kasvaimen mikroympäristössä.Erityisesti miRNA:t (miRNA:t), pienet noin 22 nukleotidin pituiset ei-koodaavat RNA:t, ovat tärkeitä transkription jälkeisiä geenisäätelyaineita, jotka hallitsevat yli 30 % ihmisen mRNA:sta miRNA-indusoidun vaimennuskompleksin (miRISC) kautta.Toxoplasma gondii voi häiritä biologisia prosesseja säätelemällä miRNA:n ilmentymistä infektoiduissa isännissä.Isännän miRNA:t sisältävät tärkeitä signaaleja isännän biologisten prosessien säätelemiseksi loisen selviytymisstrategian saavuttamiseksi.Siten isännän miRNA-profiilin muutosten tutkiminen T. gondii -infektion yhteydessä voi auttaa meitä ymmärtämään isännän ja T. gondii -bakteerin välistä vuorovaikutusta selvemmin.Todellakin, Thirugnanam et ai.15 ehdotti, että T. gondii edistää aivojen karsinogeneesiä muuttamalla sen ilmentymistä spesifisillä isäntämiRNA:illa, jotka liittyvät kasvaimen kasvuun, ja havaitsivat, että T. gondii voi aiheuttaa glioomia koe-eläimissä.
Tämä tutkimus keskittyy eksosomaalisen miR-21:n muutokseen isäntämikrogliassa, joka on infektoitunut Toxoplasma BV2:lla.Havaitsimme muuttuneen eksosomaalisen miR-21:n mahdollisen roolin U87-glioomasolujen kasvussa johtuen FoxO1/p27:n pidättymisestä tumassa, joka on yli-ilmentyneen miR-21:n kohde.
BV2:sta peräisin olevat eksosomit saatiin käyttämällä differentiaalista sentrifugointia ja validoitiin eri menetelmillä solukomponenttien tai muiden rakkuloiden aiheuttaman kontaminaation estämiseksi.SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) osoitti selkeitä kuvioita BV2-soluista ja eksosomeista uutettujen proteiinien välillä (kuvio 1A), ja näytteistä arvioitiin Alixin läsnäolo, joka analysoitiin eksosomaalisten proteiinimarkkerien Western blot -menetelmällä.Alix-leimaus löydettiin eksosomiproteiineista, mutta ei BV2-solulysaattiproteiineista (kuvio 1B).Lisäksi puhdistettu RNA BV2:sta peräisin olevista eksosomeista analysoitiin käyttämällä bioanalysaattoria.18S- ja 28S-ribosomaalisia alayksiköitä havaittiin harvoin eksosomaalisessa RNA:n migraatiokuviossa, mikä osoittaa luotettavan puhtauden (kuvio 1C).Lopuksi transmissioelektronimikroskooppi osoitti, että havaitut eksosomit olivat kooltaan noin 60–150 nm ja niillä oli eksosomimorfologialle tyypillinen kuppimainen rakenne (kuva 1D).
BV2-soluista peräisin olevien eksosomien karakterisointi.(A) Käyttöturvallisuustiedotesivu.Proteiinit eristettiin BV2-soluista tai BV2:sta peräisin olevista eksosomeista.Proteiinikuviot vaihtelevat solujen ja eksosomien välillä.(B) Eksosomaalisen markkerin (Alix) Western blot -analyysi.(C) BV2-soluista ja BV2-peräisistä eksosomeista peräisin olevan puhdistetun RNA:n arviointi bioanalysaattorilla.Siten 18S- ja 28S-ribosomaalisia alayksiköitä BV2-soluissa löydettiin harvoin eksosomaalisesta RNA:sta.(D) Transmissioelektronimikroskooppi osoitti, että BV2-soluista eristetyt eksosomit värjäytyivät negatiivisesti 2-prosenttisella uranyyliasetaatilla.Eksosomit ovat kooltaan noin 60-150 nm ja kupin muotoisia (Song ja Jung, julkaisematon data).
BV2-peräisten eksosomien solujen sisäistäminen ihmisen U87-glioomasoluihin havaittiin käyttämällä konfokaalimikroskopiaa.PKH26-leimatut eksosomit sijaitsevat U87-solujen sytoplasmassa.Tumat värjättiin DAPI:lla (kuvio 2A), mikä osoittaa, että isäntäsolut voivat sisäistää BV2-peräisiä eksosomeja ja vaikuttaa vastaanottajasolujen ympäristöön.
BV2-peräisten eksosomien internalisointi U87-glioomasoluihin ja BV2-peräisten eksosomien, jotka oli infektoitunut Toxoplasma RH:lla, indusoi U87-glioomasolujen proliferaatio.(A) U87-solujen nielaisemat eksosomit mitattuna konfokaalimikroskopialla.U87-glioomasoluja inkuboitiin eksosomien kanssa, jotka oli leimattu PKH26:lla (punainen) tai ilman kontrollia 24 tunnin ajan.Tumat värjättiin DAPI:lla (sininen) ja tarkkailtiin sitten konfokaalimikroskoopilla (mittakaavapalkki: 10 μm, x 3000).(B) U87-glioomasolujen lisääntyminen määritettiin soluproliferaatiomäärityksellä.U87-glioomasoluja käsiteltiin eksosomeilla osoitetun ajan. *P < 0,05 saatiin Studentin t-testillä. *P < 0,05 saatiin Studentin t-testillä. *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. *P < 0,05 Studentin t-testillä. *P < 0,05 通过学生t 检验获得. *P < 0,05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 saatu Studentin t-testillä.
Vahvistettuamme BV2-peräisten eksosomien sisällyttämisen U87-glioomasoluihin, suoritimme solujen lisääntymismäärityksiä tutkiaksemme BV2-peräisten Toxoplasma-peräisten eksosomien roolia ihmisen glioomasolujen kehityksessä.U87-solujen käsittely T. gondii-infektoitujen BV2-solujen eksosomeilla osoitti, että T. gondii-infektoidut BV2-peräiset eksosomit aiheuttivat merkittävästi suurempaa U87-solujen proliferaatiota kontrolliin verrattuna (kuvio 2B).
Lisäksi U118-solujen kasvulla oli samat tulokset kuin U87:llä, koska toksoplasman stimuloimat eksosomit aiheuttivat korkeimmat proliferaatiotasot (tietoja ei näytetä).Näiden tietojen perusteella voimme osoittaa, että BV2-peräisillä Toxoplasma-infektoituneilla eksosomeilla on tärkeä rooli glioomasolujen lisääntymisessä.
Tutkiaksemme toksoplasma-infektoituneiden BV2-peräisten eksosomien vaikutusta kasvaimen kehitykseen injektoimme U87-glioomasoluja nude-hiiriin ksenograftimallia varten ja injektoimme BV2-peräisiä eksosomeja tai RH-tartunnan saaneita BV2-peräisiä eksosomeja.Kun kasvaimet tulivat ilmeisiksi 1 viikon kuluttua, kukin 5 hiiren koeryhmä jaettiin kasvaimen koon mukaan saman lähtökohdan määrittämiseksi, ja kasvaimen kokoa mitattiin 22 päivän ajan.
Hiirillä, joilla oli U87-ksenograftimalli, havaittiin merkittävästi suurempi kasvaimen koko ja paino BV2-peräisessä RH-infektoidussa eksosomiryhmässä päivänä 22 (kuvio 3A, B).Toisaalta kasvaimen koossa ei ollut merkittävää eroa BV2-peräisen eksosomiryhmän ja kontrolliryhmän välillä eksosomihoidon jälkeen.Lisäksi hiirillä, joihin oli injektoitu glioomasoluja ja eksosomeja, oli visuaalisesti suurin kasvaintilavuus RH-infektoituneiden BV2-peräisten eksosomien ryhmässä (kuvio 3C).Nämä tulokset osoittavat, että BV2-peräiset Toxoplasma-infektoituneet eksosomit indusoivat gliooman kasvua hiiren kasvainmallissa.
BV2-peräisten eksosomien onkogeneesi (AC) U87-ksenograftihiirimallissa.Kasvaimen koko (A) ja paino (B) lisääntyivät merkittävästi BALB/c-nude-hiirillä, joita hoidettiin BV2:sta peräisin olevilla RH-infektoiduilla eksosomeilla.BALB/c-nude-hiiriin (C) injektoitiin ihonalaisesti 1 x 107 U87-solua, jotka oli suspendoitu Matrigel-seokseen.Kuusi päivää injektion jälkeen hiirillä käsiteltiin 100 μg BV2-peräisiä eksosomeja.Kasvaimen koko ja paino mitattiin ilmoitettuina päivinä ja vastaavasti lopettamisen jälkeen. *P < 0,05. *P < 0,05. *Р < 0,05. *P < 0,05. *P < 0,05. *P < 0,05. *Р < 0,05. *P < 0,05.
Tiedot osoittivat, että 37 miRNA:ta (16 yli-ilmentynyttä ja 21 vähentynyttä), jotka liittyvät immuniteettiin tai kasvaimen kehittymiseen, muuttuivat merkittävästi mikroglioissa Toxoplasma RH -kannalla tapahtuneen infektion jälkeen (kuvio 4A).MiR-21:n suhteelliset ilmentymistasot muuttuneiden miRNA:iden joukossa varmistettiin reaaliaikaisella RT-PCR:llä BV2:sta johdetuissa eksosomeissa, jotka oli käsitelty BV2- ja U87-soluilla.MiR-21:n ilmentyminen osoitti merkittävän kasvun eksosomeissa BV2-soluista, jotka oli infektoitu Toxoplasma gondiilla (RH-kanta) (kuvio 4B).MiR-21:n suhteelliset ilmentymistasot BV2- ja U87-soluissa lisääntyivät muuttuneiden eksosomien sisäänoton jälkeen (kuvio 4B).MiR-21:n ilmentymisen suhteelliset tasot kasvainpotilaiden aivokudoksissa ja Toxoplasma gondii:lla (ME49-kanta) infektoituneiden hiirten aivokudoksissa olivat korkeammat kuin kontrolleissa (kuvio 4C).Nämä tulokset korreloivat erojen kanssa ennustettujen ja vahvistettujen mikroRNA:iden ilmentymistasojen välillä in vitro ja in vivo.
Muutokset eksosomaalisen miP-21a-5p:n ilmentymisessä Toxoplasma gondii (RH) -tartunnan saaneessa mikrogliassa.(A) Osoittaa merkittäviä muutoksia siRNA:ssa, joka liittyy immuniteettiin tai kasvaimen kehittymiseen T. gondii RH -infektion jälkeen.(B) Suhteelliset miR-21:n ilmentymistasot havaittiin reaaliaikaisella RT-PCR:llä BV2-peräisistä eksosomeista, BV2-käsitellyistä eksosomeista ja U87-soluista.(C) Suhteellisia miR-21:n ilmentymistasoja löydettiin kasvainpotilaiden (N=3) ja Toxoplasma gondii:lla (ME49-kanta) infektoituneiden hiirten aivokudoksissa (N=3). *P < 0,05 saatiin Studentin t-testillä. *P < 0,05 saatiin Studentin t-testillä. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 saatiin käyttämällä Studentin t-testiä. *P < 0,05 通过学生t 检验获得. *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 saatu Studentin t-testillä.
Eksosomit RH-infektoituneista BV2-soluista johtivat glioomien kasvuun in vivo ja in vitro (kuvio 2, 3).Merkityksellisten mRNA:iden havaitsemiseksi tutkimme kasvainten vastaisten kohdegeenien, forkhead box O1:n (FoxO1), PTEN:n ja ohjelmoidun solukuoleman 4 (PDCD4) mRNA-tasoja U87-soluissa, jotka oli infektoitunut BV2:sta tai RH BV2:sta peräisin olevilla eksosomeilla.Bioinformatiikka-analyysi on osoittanut, että useilla kasvaimiin liittyvillä geeneillä, mukaan lukien FoxO1-, PTEN- ja PDCD4-geenit, on miR-2121,22-sitoutumiskohtia.Antituumorikohdegeenien mRNA-tasot alenivat RH-infektoiduissa BV2-peräisissä eksosomeissa verrattuna BV2-peräisiin eksosomeihin (kuvio 5A).FoxO1 osoitti alentuneita proteiinitasoja RH-infektoituneissa BV2-peräisissä eksosomeissa verrattuna BV2-peräisiin eksosomeihin (kuvio 5B).Näiden tulosten perusteella voimme vahvistaa, että RH-infektoituneesta BV2:sta peräisin olevat eksosomit säätelevät alas anti-onkogeenisiä geenejä säilyttäen roolinsa kasvaimen kasvussa.
Toxoplasma RH -tartunnan saaneet BV2-peräiset eksosomit indusoivat kasvainten vastaisten geenien suppressiota U87-glioomasoluissa Toxoplasma RH -tartunnan saaneiden BV2-peräisten eksosomien avulla.(A) FoxO1:n, PTEN:n ja PDCD4:n ilmentymisen reaaliaikainen PCR T. gondii RH-infektoidusta BV2:sta johdetuissa eksosomeissa verrattuna PBS-eksosomeihin.P-aktiini-mRNA:ta käytettiin kontrollina.(B) FoxO1:n ilmentyminen määritettiin Western blot -menetelmällä ja densitometriatiedot arvioitiin tilastollisesti käyttämällä ImageJ-ohjelmaa. *P < 0,05 saatiin Studentin t-testillä. *P < 0,05 saatiin Studentin t-testillä. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 saatiin käyttämällä Studentin t-testiä. *P < 0,05 通过学生t 检验获得. *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 saatu Studentin t-testillä.
MiP-21:n vaikutuksen ymmärtämiseksi eksosomeissa kasvaimeen liittyvään geenisäätelyyn U87-solut transfektoitiin miP-21:n inhibiittorilla käyttämällä Lipofectamine 2000:ta ja solut kerättiin 24 tuntia transfektion jälkeen.FoxO1- ja p27-ilmentymistasoja miR-21-estäjillä transfektoiduissa soluissa verrattiin soluihin, joita käsiteltiin BV2-peräisillä eksosomeilla käyttämällä qRT-PCR:ää (kuvio 6A, B).MiR-21-estäjän transfektio U87-soluihin vähensi merkittävästi Fox01- ja p27-ekspressiota (kuvio 6).
RH-infektoitunut eksosomaalinen BV2-peräinen miP-21 muutti FoxO1/p27-ekspressiota U87-glioomasoluissa.U87-solut transfektoitiin miP-21-inhibiittorilla käyttämällä Lipofectamine 2000:ta ja solut kerättiin 24 tuntia transfektion jälkeen.FoxO1:n ja p27:n ilmentymistasoja miR-21-estäjillä transfektoiduissa soluissa verrattiin BV2-peräisillä eksosomeilla käsiteltyjen solujen tasoihin käyttämällä qRT-PCR:ää (A, B).
Pakenemaan isännän immuunivastetta Toxoplasma-loinen muuttuu kudoskystaksi.Ne loistavat eri kudoksissa, mukaan lukien aivot, sydän ja luurankolihakset, koko isännän eliniän ajan ja moduloivat isännän immuunivastetta.Lisäksi ne voivat säädellä isäntäsolujen solusykliä ja apoptoosia edistäen niiden lisääntymistä14,24.Toxoplasma gondii infektoi pääasiassa isäntädendriittisoluja, neutrofiilejä ja monosyytti/makrofagilinjaa, mukaan lukien aivojen mikrogliat.Toxoplasma gondii indusoi M2-fenotyypin makrofagien erilaistumista, vaikuttaa haavan paranemiseen patogeeni-infektion jälkeen, ja se liittyy myös hypervaskularisaatioon ja granulomatoottiseen fibroosiin.Tämä Toxoplasma-infektion käyttäytymispatogeneesi voi liittyä kasvaimen kehittymiseen liittyviin markkereihin.Toxoplasman säätelemä vihamielinen ympäristö saattaa muistuttaa vastaavaa esisyöpää.Siksi voidaan olettaa, että Toxoplasma-infektion pitäisi edistää aivokasvainten kehittymistä.Itse asiassa suuria määriä Toxoplasma-infektiota on raportoitu potilaiden, joilla on erilaisia ​​aivokasvaimia, seerumissa.Lisäksi Toxoplasma gondii voi olla toinen karsinogeeninen efektori ja toimia synergistisesti auttamaan muita tarttuvia karsinogeeneja kehittämään aivokasvaimia.Tässä suhteessa on syytä huomata, että P. falciparum ja Epstein-Barr-virus myötävaikuttavat synergistisesti Burkittin lymfooman muodostumiseen.
Eksosomien roolia säätelijöinä syöpätutkimuksen alalla on tutkittu laajasti.Eksosomien rooli loisten ja tartunnan saaneiden isäntien välillä on kuitenkin edelleen huonosti ymmärretty.Tähän mennessä erilaiset säätelijät, mukaan lukien eritetyt proteiinit, ovat selittäneet biologisia prosesseja, joilla alkueläinloiset vastustavat isäntähyökkäystä ja jatkavat infektiota.Viime aikoina on yleistynyt käsitys siitä, että alkueläimiin liittyvät mikrovesikkelit ja niiden mikro-RNA:t ovat vuorovaikutuksessa isäntäsolujen kanssa luodakseen suotuisan ympäristön niiden selviytymiselle.Siksi tarvitaan lisätutkimuksia muuttuneiden eksosomaalisten miRNA:iden ja glioomasolujen lisääntymisen välisen suhteen löytämiseksi.MikroRNA-muutos (klusterigeenit miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 ja miR-17-92) sitoutuu STAT3-promoottoriin toksoplasma-infektoituneissa ihmisen makrofageissa, on säädelty ja indusoi anti- -apoptoosi vasteena Toxoplasma gondii -infektiolle 29 .Toksoplasma-infektio lisää miR-17-5p:n ja miR-106b-5p:n ilmentymistä, jotka liittyvät useisiin hyperproliferatiivisiin sairauksiin 30 .Nämä tiedot viittaavat siihen, että Toxoplasma-infektion säätelemät isännän miRNA:t ovat tärkeitä molekyylejä loisten selviytymiselle ja patogeneesille isännän biologisessa käyttäytymisessä.
Muuttuneet miRNA:t voivat vaikuttaa erilaisiin käyttäytymistyyppeihin pahanlaatuisten solujen, mukaan lukien glioomien, alkamisen ja etenemisen aikana: kasvusignaalien omavaraisuus, epäherkkyys kasvua inhiboiville signaaleille, apoptoosin välttäminen, rajoittamaton replikaatiopotentiaali, angiogeneesi, invaasiot ja etäpesäkkeet sekä tulehdus.Glioomassa muuttuneet miRNA:t on tunnistettu useissa ilmentymisprofilointitutkimuksissa.
Tässä tutkimuksessa vahvistimme korkeat miRNA-21-ekspression tasot toksoplasma-infektoituneissa isäntäsoluissa.miR-21 on tunnistettu yhdeksi yleisimmin yli-ilmennetyistä mikroRNA:ista kiinteissä kasvaimissa, mukaan lukien glioomat, 33 ja sen ilmentyminen korreloi gliooman asteen kanssa.Kertyvä näyttö viittaa siihen, että miR-21 on uusi onkogeeni, joka toimii anti-apoptoottisena tekijänä gliooman kasvussa ja on erittäin yli-ilmentynyt ihmisen aivojen pahanlaatuisten kasvainten kudoksissa ja plasmassa.Mielenkiintoista on, että miR-21:n inaktivaatio glioomasoluissa ja kudoksissa laukaisee solujen lisääntymisen eston kaspaasista riippuvaisen apoptoosin vuoksi.MiR-21:n ennustettujen kohteiden bioinformaattinen analyysi paljasti useita tuumorisuppressorigeenejä, jotka liittyvät apoptoosin reitteihin, mukaan lukien ohjelmoitu solukuolema 4 (PDCD4), tropomyosiini (TPM1), PTEN ja forkhead box O1 (FoxO1) miR-2121:n sitoutumiskohdan kanssa..22.38.
FoxO1, yhtenä transkriptiotekijöistä (FoxO), osallistuu erityyppisten ihmisen syöpien kehittymiseen ja voi säädellä kasvainsuppressorigeenien, kuten p21, p27, Bim ja FasL40, ilmentymistä.FoxO1 voi sitoa ja aktivoida solusyklin estäjiä, kuten p27:n tukahduttaakseen solujen kasvua.Lisäksi FoxO1 on PI3K/Akt-signaloinnin avainefektori ja säätelee monia biologisia prosesseja, kuten solusyklin etenemistä ja solujen erilaistumista aktivoimalla p2742-transkription.
Yhteenvetona uskomme, että toksoplasman infektoituneesta mikrogliasta peräisin oleva eksosomaalinen miR-21 voi olla tärkeä rooli glioomasolujen kasvun säätelijänä (kuvio 7).Lisätutkimuksia tarvitaan kuitenkin suoran yhteyden löytämiseksi eksosomaalisen miR-21:n, muuttuneen Toxoplasma-infektion ja gliooman kasvun välillä.Näiden tulosten odotetaan tarjoavan lähtökohdan Toxoplasma-infektion ja gliooman esiintyvyyden välisen suhteen tutkimiselle.
Tässä tutkimuksessa ehdotetaan kaaviota gliooman (aivojen) karsinogeneesin mekanismista.Kirjoittaja piirtää PowerPoint 2019:ssä (Microsoft, Redmond, WA).
Kaikki tämän tutkimuksen kokeelliset protokollat, mukaan lukien eläinten käyttö, olivat Soulin kansallisen yliopiston eläinten hoito- ja käyttäjäkomitean standardieettisten ohjeiden mukaisia ​​ja Soulin kansallisen yliopiston lääketieteellisen korkeakoulun institutionaalisen arviointilautakunnan hyväksymät (IRB-numero SNU- 150715).-2).Kaikki kokeelliset toimenpiteet suoritettiin ARRIVEn suositusten mukaisesti.
BV2-hiiren mikrogliasoluja ja U87-ihmisen glioomasoluja viljeltiin Dulbeccon Modified Eagle's Mediumissa (DMEM; Welgene, Soul, Korea) ja Roswell Park Memorial Institute's Mediumissa (RPMI; Welgene), kukin sisälsi 10 % naudan sikiön seerumia, 4 mM l- glutamiinia, 0,2 mM penisilliiniä ja 0,05 mM streptomysiiniä.Soluja viljeltiin inkubaattorissa 5 % C02:lla 37 °C:ssa.Toista glioomasolulinjaa, U118, käytettiin vertailuun U87-soluihin.
Eksosomien eristämiseksi T. gondii-infektoituneista RH- ja ME49-kannoista T. gondii tachyzoites (RH-kanta) otettiin talteen 6 viikon ikäisten BALB/c-hiirten vatsaontelosta, jotka oli injektoitu 3-4 päivää aikaisemmin.Takytsoiitit pestiin kolme kertaa PBS:llä ja puhdistettiin sentrifugoimalla 40 % Percollissa (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)43.ME49-kannan takytsoiittien saamiseksi BALB/c-hiiriin injektoitiin vatsaontelonsisäisesti 20 kudoskystaa ja takytsoiitin transformaatio kystissä kerättiin pesemällä vatsaontelo 6-8 päivänä infektion jälkeen (PI).PBS:llä infektoidut hiiret.ME49-takytsoiitteja kasvatettiin soluissa, joihin oli lisätty 100 μg/ml penisilliiniä (Gibco/BRL, Grand Island, NY, USA), 100 μg/ml streptomysiiniä (Gibco/BRL) ja 5 % naudan sikiön seerumia (Lonza, Walkersville, MD) .., USA) 37 °C:ssa ja 5 % hiilidioksidissa.Vero-soluissa viljelyn jälkeen ME49-takytsoiitit vietiin kahdesti 25 gaugen neulan läpi ja sitten 5 um suodattimen läpi roskien ja solujen poistamiseksi.Pesun jälkeen takytsoiitit suspendoitiin uudelleen PBS44:ään.Toxoplasma gondii -kannan ME49 kudoskystoja ylläpidettiin injektoimalla vatsaonteloon infektoituneiden C57BL/6-hiirten aivoista eristettyjä kystoja (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Korea).ME49-infektoituneiden hiirten aivot kerättiin 3 kuukauden PI:n jälkeen ja jauhettiin mikroskoopilla kystojen eristämiseksi.Tartunnan saaneita hiiriä pidettiin erityisissä patogeenittomissa olosuhteissa (SPF) Soulin kansallisen yliopiston lääketieteellisessä korkeakoulussa.
Kokonais-RNA uutettiin BV2-peräisistä eksosomeista, BV2-soluista ja kudoksista käyttämällä miRNeasy Mini Kit -sarjaa (Qiagen, Hilden, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaisesti, mukaan lukien eluointivaiheen inkubaatioaika.RNA-pitoisuus määritettiin NanoDrop 2000 spektrofotometrillä.RNA-mikrosirujen laatu arvioitiin käyttämällä Agilent 2100 -bioanalysaattoria (Agilent Technologies, Amstelveen, Alankomaat).
DMEM, jossa oli 10 % eksosomiköyhä FBS, valmistettiin ultrasentrifugoimalla 100 000 g:ssä 16 tunnin ajan 4 °C:ssa ja suodatettiin 0,22 um:n suodattimen läpi (Nalgene, Rochester, NY, USA).BV2-soluja, 5 x 105, viljeltiin DMEM:ssä, joka sisälsi 10 % eksosomeista poistettua FBS:ää ja 1 % antibiootteja 37 °C:ssa ja 5 % C02:ssa.24 tunnin inkubaation jälkeen kannan RH tai ME49 (MOI = 10) takytsoiitteja lisättiin soluihin ja ei-tunkeutuvat loiset poistettiin tunnin sisällä ja täytettiin uudelleen DMEM:llä.Eksosomit BV2-soluista eristettiin modifioidulla differentiaalisella sentrifugoinnilla, joka on laajimmin käytetty menetelmä.Suspendoi eksosomipelletti uudelleen 300 µl:aan PBS:ää RNA- tai proteiinianalyysiä varten.Eristettyjen eksosomien konsentraatio määritettiin käyttämällä BCA-proteiinimäärityspakkausta (Pierce, Rockford, IL, USA) ja NanoDrop 2000 -spektrofotometriä.
Sakat BV2-soluista tai BV2:sta peräisin olevat eksosomit lyysattiin PRO-PREP™-proteiiniuuttoliuoksessa (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Korea) ja proteiinit ladattiin Coomassie briljantinsinisillä värjätyille 10 % SDS-polyakryyliamidigeeleille.Lisäksi proteiinit siirrettiin PVDF-kalvoille 2 tunnin ajaksi.Western blotit validoitiin käyttämällä Alix-vasta-ainetta (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) eksosomaalisena markkerina.Toissijaisena vasta-aineena käytettiin HRP-konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG:tä (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) ja LAS-1000 plus luminesenssikuva-analysaattoria (Fuji Photography Film, Tokio, Japani)..Transmissioelektronimikroskoopilla tutkittiin eksosomien kokoa ja morfologiaa.BV2-soluista eristetyt eksosomit (6,40 µg/µl) valmistettiin hiilipäällysteisille verkoille ja värjättiin negatiivisesti 2-prosenttisella uranyyliasetaatilla 1 minuutin ajan.Valmistettuja näytteitä tarkkailtiin 80 kV:n kiihdytysjännitteellä käyttämällä JEOL 1200-EX II:ta (Tokio, Japani), joka oli varustettu ES1000W Erlangshen CCD -kameralla (Gatan, Pleasanton, CA, USA).
BV2-peräisiä eksosomeja värjättiin käyttämällä PKH26 Red Fluorescent Linker Kit -sarjaa (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa.U87-soluja, 2 x 105, joissa oli PKH26-leimattuja eksosomeja (punaisia) tai ei eksosomeja negatiivisena kontrollina, inkuboitiin 37 °C:ssa 24 tuntia 5 % C02-inkubaattorissa.U87-soluytimet värjättiin DAPI:lla (sininen), U87-solut kiinnitettiin 4-prosenttisessa paraformaldehydissä 15 minuutin ajan 4 °C:ssa ja analysoitiin sitten Leica TCS SP8 STED CW -konfokaalimikroskooppijärjestelmässä (Leica Microsystems, Mannheim, Saksa).havaittavissa.
cDNA syntetisoitiin siRNA:sta käyttämällä Mir-X siRNA:n ensimmäisen juosteen synteesiä ja SYBR qRT-PCR -kittiä (Takara Bio Inc., Shiga, Japani).Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR suoritettiin käyttämällä iQ5 reaaliaikaista PCR-detektiojärjestelmää (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) käyttämällä alukkeita ja templaatteja, jotka oli sekoitettu SYBR Premixiin.DNA:ta monistettiin 40 denaturaatiosykliä 95 °C:ssa 15 sekunnin ajan ja pariutumista 60 °C:ssa 60 sekunnin ajan.Jokaisesta PCR-reaktiosta saadut tiedot analysoitiin käyttämällä iQ™5-optisen järjestelmäohjelmiston (Bio-Rad) data-analyysimoduulia.Suhteelliset muutokset geeniekspressiossa valittujen kohdegeenien ja β-aktiini/siRNA:n (ja U6) välillä laskettiin käyttämällä standardikäyrämenetelmää.Käytetyt alukesekvenssit on esitetty taulukossa 1.
3 x 104 U87-glioomasolua kylvettiin 96-kuoppaisille levyille ja sekoitettiin BV2:sta peräisin olevien toksoplasma-infektoituneiden eksosomien (50 µg/ml) tai BV2:sta peräisin olevien ei-pulssieksosomien (50 µg/ml) kanssa kontrolleina 12, 18 ja 36 tunnin kohdalla. .Solujen lisääntymisnopeus määritettiin käyttämällä Cell Counting Kit-8 -sarjaa (Dojindo, Kumamoto, Japani) (lisäkuvat S1-S3)46.
5 viikon ikäiset naaraspuoliset BALB/c nude-hiiret ostettiin Orient Biolta (Seongnam-si, Etelä-Korea) ja niitä pidettiin yksittäin steriileissä häkeissä huoneenlämpötilassa (22 ± 2 °C) ja kosteudessa (45 ± 15 °C).%) huoneenlämmössä (22±2°C) ja kosteudessa (45±15%).12 tunnin valosykli ja 12 tunnin pimeäjakso suoritettiin SPF:llä (Seoul National University School of Medicine Animal Center).Hiiret jaettiin satunnaisesti kolmeen 5 hiiren ryhmään ja kaikkiin ryhmiin injektoitiin ihonalaisesti 400 ml PBS:ää, joka sisälsi 1 x 107 U87-glioomasolua ja kasvutekijävähennetty BD Matrigel™ (BD Science, Miami, FL, USA).Kuusi päivää kasvaininjektion jälkeen 200 mg BV2-soluista peräisin olevia eksosomeja (jossa oli/ilman Toxoplasma-infektiota) injektoitiin kasvainkohtaan.Kaksikymmentäkaksi päivää kasvaininfektion jälkeen hiirten kasvaimen koko mitattiin kussakin ryhmässä jarrusatulalla kolme kertaa viikossa, ja kasvaimen tilavuus laskettiin kaavalla: 0,5 × (leveys) × 2 × pituus.
MikroRNA-ilmentymisanalyysi miRCURYTM LNA-miRNA-matriisia käyttämällä, 7. sukupolvi on, mmu- ja rno-taulukoita (EXIQON, Vedbaek, Tanska), joka kattaa 1119 hyvin karakterisoitua hiirtä 3100 ihmisen, hiiren ja rotan miRNA-sieppauskoettimen joukossa.Tämän menettelyn aikana 250-1000 ng kokonais-RNA:ta poistettiin 5'-fosfaatista käsittelemällä vasikan suolen alkalisella fosfataasilla, mitä seurasi leimaus Hy3-vihreällä fluoresoivalla väriaineella.Leimatut näytteet hybridisoitiin sitten lataamalla mikrosirulevyjä käyttämällä hybridisaatiokammiosarjaa (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) ja hybridisaatiolasipakkausta (Agilent Technologies).Hybridisaatiota suoritettiin 16 tuntia 56 °C:ssa, minkä jälkeen mikrosirut pestiin valmistajan suositusten mukaisesti.Käsitellyt mikrosirulevyt skannattiin sitten käyttämällä Agilent G2565CA -mikrosiruskanneria (Agilent Technologies).Skannatut kuvat tuotiin käyttämällä Agilent Feature Extraction -ohjelmistoversiota 10.7.3.1 (Agilent Technologies), ja kunkin kuvan fluoresenssin intensiteetti määritettiin käyttämällä vastaavaa muokatun Exiqon-protokollan GAL-tiedostoa.Tämän tutkimuksen mikrosirutiedot on tallennettu GEO-tietokantaan talletusnumerolla GPL32397.
Kypsän eksosomaalisen miRNA:n ilmentymisprofiilit toksoplasmalla infektoituneiden RH- tai ME49-kantojen mikroglioissa analysoitiin käyttämällä erilaisia ​​verkkotyökaluja.Kasvaimen kehittymiseen liittyvät miRNA:t tunnistettiin käyttämällä miRWalk2.0:aa (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) ja suodatettiin pois normalisoidulla signaalin intensiteetillä (log2) yli 8,0.MiRNA:iden joukossa differentiaalisesti ekspressoituneiden miRNA:iden havaittiin muuttuneen yli 1,5-kertaisesti T. gondii:lla infektoitujen RH- tai ME49-kantojen muuttamien miRNA:iden suodatinanalyysin perusteella.
Solut kylvettiin kuusikuoppaisille levyille (3 x 105 solua/kuoppa) opti-MEM:ssä (Gibco, Carlsbad, CA, USA) käyttämällä Lipofectamine 2000:ta (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).Transfektoituja soluja viljeltiin 6 tuntia ja sitten väliaine vaihdettiin tuoreeseen täydelliseen elatusaineeseen.Solut kerättiin 24 tuntia transfektion jälkeen.
Tilastollinen analyysi suoritettiin pääosin Studentin t-testillä Excel-ohjelmistolla (Microsoft, Washington, DC, USA).Kokeellista eläinanalyysiä varten suoritettiin kaksisuuntainen ANOVA käyttäen Prism 3.0 -ohjelmistoa (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). P-arvoja < 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevinä. P-arvoja < 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevinä. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P-arvoja <0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävinä. P 值< 0,05 被认为具有统计学意义. P 值 < 0,05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P-arvoja <0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävinä.
Kaikki tässä tutkimuksessa käytetyt kokeelliset protokollat ​​hyväksyttiin Soulin kansallisen yliopiston lääketieteellisen korkeakoulun Institutional Review Boardin toimesta (IRB-numero SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. et ai.Arvioitu maailmanlaajuinen syövän ilmaantuvuus ja kuolleisuus vuonna 2018: GLOBOCAN-lähteet ja -menetelmät.Tulkinta.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Katsaus aivokasvainten riskitekijöihin ja niiden terapeuttisiin toimenpiteisiin. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Katsaus aivokasvainten riskitekijöihin ja niiden terapeuttisiin toimenpiteisiin.Rashid, S., Rehman, K. ja Akash, MS Katsaus aivokasvainten riskitekijöihin ja merkittäviin terapeuttisiin toimenpiteisiin. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Syvä ymmärrys aivokasvaimen riskitekijöistä ja terapeuttisista toimenpiteistä.Rashid, S., Rehman, K. ja Akash, MS Katsaus aivokasvainten riskitekijöihin ja merkittäviin terapeuttisiin toimenpiteisiin.Biolääketieteellinen tiede.Farmaseutti.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakteeri-virus vuorovaikutukset ihmisen suun ja naisten sukupuolielinten syövissä: Yhteenveto epidemiologisista ja laboratoriotutkimuksista. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakteeri-virus vuorovaikutukset ihmisen suun ja naisten sukupuolielinten syövissä: Yhteenveto epidemiologisista ja laboratoriotutkimuksista.Kato I., Zhang J. ja Sun J. Bakteeri-virusvuorovaikutukset ihmisen maha-suolikanavan ja naisten sukupuolielinten syövissä: tiivistelmä epidemiologisista ja laboratoriotiedoista. Kato I., Zhang, J. & Sun, J. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakteeri-virus vuorovaikutus ihmisen suuontelon ruuansulatuksessa ja naisen lisääntymiskanavassa: tiivistelmä kansantautitieteen ja laboratoriotutkimuksen todisteista.Kato I., Zhang J. ja Sun J. Bakteeri-virus vuorovaikutukset ihmisen maha-suolikanavan syövässä ja naisten sukupuolielinten syövässä: tiivistelmä epidemiologisista ja laboratoriotiedoista.Cancer 14, 425 (2022).
Magon, KL & Parish, JL Infektiosta syöpään: Kuinka DNA-kasvainvirukset muuttavat isäntäsolujen hiilen ja lipidiaineenvaihduntaa. Magon, KL & Parish, JL Infektiosta syöpään: Kuinka DNA-kasvainvirukset muuttavat isäntäsolujen hiilen ja lipidiaineenvaihduntaa.Mahon, KL ja Parish, JL Tulitartunta syöpään: kuinka DNA-pohjaiset kasvainvirukset muuttavat isäntäsolun keskushiilen ja lipidiaineenvaihduntaa. Magon, KL & Parish, JL 从感染到癌症：DNA 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质仂 Magon, KL & Parish, JL Infektiosta syöpään: kuinka DNA-kasvainvirukset muuttavat isäntäsolujen hiilen ja lipidiaineenvaihduntaa.Mahon, KL ja Parish, JL Tulitulehdus syöpään: kuinka DNA-kasvainvirukset muuttavat keskushiilen ja lipidiaineenvaihduntaa isäntäsoluissa.Avoin biologia.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM et ai.Skistosomien katekoliestrogeenit ja maksaraumat ja helmintiin liittyvä syöpä.edessä.kuuma sisällä.5, 444 (2014).