Kiitos vierailustasi Nature.comissa.Käyttämässäsi selainversiossa on rajoitettu CSS-tuki.Parhaan kokemuksen saamiseksi suosittelemme käyttämään päivitettyä selainta (tai poistamaan Yhteensopivuustila käytöstä Internet Explorerissa).Sillä välin varmistaaksemme jatkuvan tuen hahmonnamme sivuston ilman tyylejä ja JavaScriptiä.
Keuhkojen kystisen fibroosin hoitoon käytettävät geenivektorit on kohdistettava johtaviin hengitysteihin, koska perifeerisellä keuhkojen transduktiolla ei ole terapeuttista vaikutusta.Viruksen transduktion tehokkuus liittyy suoraan kantajan viipymäaikaan.Kuljetusnesteet, kuten geenin kantajat, diffundoituvat kuitenkin luonnollisesti keuhkorakkuloihin sisäänhengityksen aikana, ja minkä tahansa muotoiset terapeuttiset hiukkaset poistuvat nopeasti limakalvokuljetuksella.Geenikantajien viipymäajan pidentäminen hengitysteissä on tärkeää, mutta vaikeasti saavutettavissa.Kantajakonjugoidut magneettiset hiukkaset, jotka voidaan ohjata hengitysteiden pintaan, voivat parantaa alueellista kohdistusta.In vivo -kuvantamisen ongelmien vuoksi tällaisten pienten magneettisten hiukkasten käyttäytyminen hengitysteiden pinnalla käytetyn magneettikentän läsnä ollessa on huonosti ymmärretty.Tämän tutkimuksen tavoitteena oli käyttää synkrotronikuvausta visualisoimaan in vivo magneettipartikkelien sarjan liikettä nukutettujen rottien henkitorvessa, jotta voidaan tutkia yksittäisten ja bulkkihiukkasten dynamiikkaa ja käyttäytymismalleja in vivo.Sitten arvioimme myös, lisäisikö lentiviruksen magneettisten hiukkasten toimittaminen magneettikentän läsnä ollessa transduktion tehokkuutta rotan henkitorvessa.Synkrotroniröntgenkuvaus osoittaa magneettisten hiukkasten käyttäytymisen kiinteissä ja liikkuvissa magneettikentissä in vitro ja in vivo.Hiukkasia ei voi helposti vetää elävien hengitysteiden pinnan yli magneeteilla, mutta kuljetuksen aikana kerrostumat keskittyvät näkökenttään, jossa magneettikenttä on voimakkain.Transduktiotehokkuus kasvoi myös kuusinkertaiseksi, kun lentiviruksen magneettiset hiukkaset toimitettiin magneettikentän läsnäollessa.Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että lentiviruksen magneettiset hiukkaset ja magneettikentät voivat olla arvokkaita tapoja parantaa geenivektorin kohdistusta ja transduktiotasoja johtavissa hengitysteissä in vivo.
Kystinen fibroosi (CF) johtuu muunnelmista yksittäisessä geenissä, jota kutsutaan CF-transmembraanisen konduktanssin säätelijäksi (CFTR).CFTR-proteiini on ionikanava, jota esiintyy monissa epiteelisoluissa kaikkialla kehossa, mukaan lukien hengitystiet, joka on tärkein kohta kystisen fibroosin patogeneesissä.CFTR:n viat johtavat epänormaaliin veden kulkeutumiseen, hengitysteiden pinnan kuivumiseen ja hengitysteiden pinnan nestekerroksen (ASL) syvyyden vähenemiseen.Se heikentää myös mukosiliaarisen kuljetusjärjestelmän (MCT) kykyä puhdistaa hengitysteitä sisäänhengitetyistä hiukkasista ja taudinaiheuttajista.Tavoitteenamme on kehittää lentiviraalinen (LV) geeniterapia, joka tuottaa oikean kopion CFTR-geenistä ja parantaa ASL-, MCT- ja keuhkojen terveyttä sekä jatkaa uusien teknologioiden kehittämistä, joilla voidaan mitata näitä parametreja in vivo1.
LV-vektorit ovat yksi johtavista ehdokkaista kystisen fibroosin geeniterapiassa pääasiassa siksi, että ne voivat integroida terapeuttisen geenin pysyvästi hengitysteiden tyvisoluihin (hengitysteiden kantasoluihin).Tämä on tärkeää, koska ne voivat palauttaa normaalin nesteytyksen ja liman puhdistuman erilaistumalla toiminnallisiksi geenikorjatuiksi hengitysteiden pintasoluiksi, jotka liittyvät kystiseen fibroosiin, mikä johtaa elinikäisiin hyötyihin.LV-vektorit on suunnattava johtavia hengitysteitä vasten, koska tästä alkaa keuhkojen osallisuus CF:ssä.Vektorin kulkeutuminen syvemmälle keuhkoihin voi johtaa alveolaariseen transduktioon, mutta tällä ei ole terapeuttista vaikutusta kystisessä fibroosissa.Nesteet, kuten geenin kantajat, kulkeutuvat kuitenkin luonnollisesti keuhkorakkuloihin hengitettynä synnytyksen jälkeen3,4 ja MCT:t karkottavat nopeasti terapeuttiset hiukkaset suuonteloon.LV-transduktion tehokkuus liittyy suoraan aikaan, jonka vektori pysyy lähellä kohdesoluja mahdollistaakseen soluunoton - "viipymäaika" 5, jota lyhenee helposti tyypillinen alueellinen ilmavirta sekä koordinoitu liman ja MCT-hiukkasten otto.Kystisen fibroosin tapauksessa kyky pidentää LV:n viipymisaikaa hengitysteissä on tärkeää korkean transduktion saavuttamiseksi tällä alueella, mutta se on toistaiseksi ollut haastavaa.
Tämän esteen voittamiseksi ehdotamme, että LV-magneettiset hiukkaset (MP:t) voivat auttaa kahdella toisiaan täydentävällä tavalla.Ensinnäkin ne voidaan ohjata magneetilla hengitysteiden pintaan parantamaan kohdistusta ja auttamaan geenin kantajahiukkasia olemaan oikealla hengitysteiden alueella;ja ASL) siirtyvät solukerrokseen 6. MP:itä käytetään laajalti kohdistetuina lääkekuljetusvälineinä, kun ne sitoutuvat vasta-aineisiin, kemoterapialääkkeisiin tai muihin pieniin molekyyleihin, jotka kiinnittyvät solukalvoihin tai sitoutuvat vastaaviin solupinnan reseptoreihin ja kerääntyvät kasvainkohtiin staattisen sähkön läsnäolo.Magneettikentät syövän hoitoon 7. Muut "hypertermiset" menetelmät tähtäävät kasvainsolujen tappamiseen kuumentamalla MP:itä, kun ne altistetaan värähteleville magneettikentille.Magneettisen transfektion periaatetta, jossa magneettikenttää käytetään transfektioaineena edistämään DNA:n siirtymistä soluihin, käytetään yleisesti in vitro käyttäen erilaisia ​​ei-virus- ja virusgeenivektoreita vaikeasti transdusoitavissa solulinjoissa. ..LV-magnetotransfektion tehokkuus LV MP:n kuljetuksella in vitro ihmisen keuhkoputkien epiteelin solulinjaan staattisen magneettikentän läsnä ollessa vahvistettiin, mikä lisäsi transduktion tehokkuutta 186-kertaisesti verrattuna pelkkään LV-vektoriin.LV MT:tä on sovellettu myös kystisen fibroosin in vitro -malliin, jossa magneettinen transfektio lisäsi LV-transduktiota ilma-neste-rajapintaviljelmissä kertoimella 20 kystisen fibroosin ysköksen läsnä ollessa10.Elinten in vivo magnetotransfektio on kuitenkin saanut suhteellisen vähän huomiota, ja sitä on arvioitu vain muutamissa eläintutkimuksissa11,12,13,14,15, erityisesti keuhkoissa16,17.Magneettisen transfektion mahdollisuudet kystisen fibroosin keuhkohoidossa ovat kuitenkin selvät.Tan et ai.(2020) totesi, että "validointitutkimus magneettisten nanopartikkelien tehokkaasta keuhkoihin johtamisesta tasoittaa tietä tuleville CFTR-inhalaatiostrategioille, joilla parannetaan kystistä fibroosia sairastavien potilaiden kliinisiä tuloksia"6.
Pienten magneettisten hiukkasten käyttäytymistä hengitysteiden pinnalla käytetyn magneettikentän läsnä ollessa on vaikea visualisoida ja tutkia, ja siksi niitä ymmärretään huonosti.Muissa tutkimuksissa olemme kehittäneet synchrotron Propagation Based Phase Contrast X-Ray Imaging (PB-PCXI) -menetelmän ei-invasiiviseen kuvantamiseen ja ASL18-syvyyden ja MCT19-käyttäytymisen pienten in vivo -muutosten kvantifiointiin20 kaasukanavan pinnan hydraation suoraan mittaamiseksi. ja sitä käytetään varhaisena indikaattorina hoidon tehokkuudesta.Lisäksi MCT-pisteytysmenetelmämme käyttää 10–35 µm halkaisijaltaan alumiinioksidista tai korkean taitekertoimen lasista koostuvia hiukkasia MCT-markkereina, jotka näkyvät PB-PCXI21:llä.Molemmat menetelmät soveltuvat useiden hiukkastyyppien, mukaan lukien MP:iden, kuvaamiseen.
Korkean spatiaalisen ja ajallisen resoluution ansiosta PB-PCXI-pohjaiset ASL- ja MCT-määrityksemme sopivat hyvin yksittäisten ja bulkkihiukkasten dynamiikan ja käyttäytymismallien tutkimiseen in vivo auttamaan meitä ymmärtämään ja optimoimaan MP-geenin toimitusmenetelmiä.Tässä käyttämämme lähestymistapa perustuu tutkimuksiimme, joissa käytettiin SPring-8 BL20B2 -sädelinjaa, jossa visualisoimme nesteen liikkeen sen jälkeen, kun hiirten nenä- ja keuhkojen hengitysteihin oli annosteltu valevektoria, mikä auttaa selittämään havaittuja heterogeenisiä geeniekspressiomallejamme. meidän geenissämme.eläinkokeet kantaja-annoksella 3,4.
Tämän tutkimuksen tavoitteena oli käyttää PB-PCXI-synkrotronia visualisoimaan MP-sarjan in vivo -liikkeet elävien rottien henkitorvessa.Nämä PB-PCXI-kuvaustutkimukset on suunniteltu testaamaan MP-sarjaa, magneettikentän voimakkuutta ja sijaintia niiden vaikutuksen määrittämiseksi MP-liikkeeseen.Oletimme, että ulkoinen magneettikenttä auttaisi toimitettua MF:ää pysymään tai siirtymään kohdealueelle.Nämä tutkimukset antoivat meille myös mahdollisuuden määrittää magneettikonfiguraatiot, jotka maksimoivat henkitorveen laskeutumisen jälkeen jääneiden hiukkasten määrän.Toisessa tutkimussarjassa pyrimme käyttämään tätä optimaalista konfiguraatiota osoittamaan transduktiomallia, joka johtuu LV-MP:iden in vivo -kuljetuksesta rotan hengitysteihin, olettaen, että LV-MP:iden toimittaminen hengitysteihin kohdistuvan kohdistamisen yhteydessä johtaisi lisääntynyt LV-transduktiotehokkuus..
Kaikki eläintutkimukset suoritettiin Adelaiden yliopiston (M-2019-060 ja M-2020-022) ja SPring-8 Synchrotron Animal Ethics Committeen hyväksymien protokollien mukaisesti.Kokeet suoritettiin ARRIVEn suositusten mukaisesti.
Kaikki röntgenkuvat otettiin BL20XU-sädelinjalla SPring-8-synkrotronissa Japanissa käyttämällä samanlaista järjestelyä kuin aiemmin on kuvattu21,22.Lyhyesti sanottuna koelaatikko sijaitsi 245 metrin päässä synkrotronivarastorenkaasta.Näytteen ja detektorin välinen etäisyys on 0,6 m partikkelikuvaustutkimuksissa ja 0,3 m in vivo -kuvaustutkimuksissa vaihekontrastivaikutusten luomiseksi.Käytettiin monokromaattista sädettä, jonka energia oli 25 keV.Kuvat otettiin käyttämällä korkearesoluutioista röntgenanturia (SPring-8 BM3), joka oli kytketty sCMOS-ilmaisimeen.Muunnin muuntaa röntgensäteet näkyväksi valoksi käyttämällä 10 µm paksua tuikelaitetta (Gd3Al2Ga3O12), joka sitten ohjataan sCMOS-anturiin käyttämällä ×10 (NA 0,3) mikroskoopin objektiivia.sCMOS-ilmaisin oli Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japani), jonka ryhmäkoko oli 2048 × 2048 pikseliä ja raakapikselin koko 6,5 × 6,5 µm.Tämä asetus antaa tehokkaan isotrooppisen pikselikoon 0,51 µm ja näkökentän noin 1,1 mm × 1,1 mm.100 ms:n altistuksen kesto valittiin maksimoimaan hengitysteiden sisällä ja ulkopuolella olevien magneettisten hiukkasten signaali-kohinasuhde ja minimoimaan hengityksen aiheuttamat liikeartefaktit.In vivo -tutkimuksia varten röntgenpolulle asetettiin nopea röntgensuljin säteilyannoksen rajoittamiseksi estämällä röntgensäde altistusten välillä.
LV-mediaa ei käytetty missään SPring-8 PB-PCXI -kuvaustutkimuksessa, koska BL20XU-kuvauskammio ei ole Biosafety Level 2 -sertifioitu.Sen sijaan valitsimme joukon hyvin karakterisoituja MP:itä kahdelta kaupalliselta toimittajalta, jotka kattavat erilaisia ​​kokoja, materiaaleja, rautapitoisuuksia ja sovelluksia , — ensin ymmärtääksemme, kuinka magneettikentät vaikuttavat MP:ien liikkeisiin lasikapillaareissa, ja sitten elävät hengitystiet.pinta.MP:n koko vaihtelee 0,25 - 18 µm ja se on valmistettu eri materiaaleista (katso taulukko 1), mutta kunkin näytteen koostumus, mukaan lukien MP:n magneettisten hiukkasten koko, ei ole tiedossa.Laajojen MCT-tutkimuksiemme 19, 20, 21, 23, 24 perusteella odotamme, että jopa 5 µm:n MP:t voidaan nähdä henkitorven hengitysteiden pinnalla esimerkiksi vähentämällä peräkkäiset kehykset MP-liikkeen paremman näkyvyyden näkemiseksi.Yksittäinen 0,25 µm:n MP on pienempi kuin kuvantamislaitteen resoluutio, mutta PB-PCXI:n odotetaan havaitsevan niiden tilavuuskontrastit ja pinnan nesteen liikkeet, jolle ne on kerrostettu kerrostumisen jälkeen.
Näytteet jokaisesta taulukon MP:stä.1 valmistettiin 20 μl:n lasikapillaareissa (Drummond Microcaps, PA, USA), joiden sisähalkaisija oli 0,63 mm.Korpuskulaarisia hiukkasia on saatavana vedessä, kun taas CombiMag-hiukkasia on saatavana valmistajan omassa nesteessä.Jokainen putki täytetään puoliksi nesteellä (noin 11 µl) ja asetetaan näytetelineen päälle (katso kuva 1).Lasikapillaarit asetettiin vaakasuoraan kuvantamiskammiossa olevalle tasolle ja sijoitettiin nesteen reunoihin.Halkaisijaltaan 19 mm (28 mm pitkä) harvinaisesta maametallista, neodyymistä, raudasta ja boorista (NdFeB) valmistettu nikkelikuorimagneetti (N35, luettelonro LM1652, Jaycar Electronics, Australia), jonka remanenssi on 1,17 T, kiinnitettiin erillinen siirtotaulukko saavuttaaksesi Muuta etänä sijaintiasi renderöinnin aikana.Röntgenkuvaus alkaa, kun magneetti on sijoitettu noin 30 mm näytteen yläpuolelle ja kuvia otetaan 4 ruutua sekunnissa.Kuvauksen aikana magneetti tuotiin lähelle lasikapillaariputkea (noin 1 mm etäisyydelle) ja siirrettiin sitten putkea pitkin kenttävoimakkuuden ja sijainnin vaikutuksen arvioimiseksi.
In vitro -kuvausjärjestelmä, joka sisältää MP-näytteitä lasikapillaareissa xy-näytteen translaatiovaiheessa.Röntgensäteen reitti on merkitty punaisella katkoviivalla.
Kun MP:iden in vitro -näkyvyys oli vahvistettu, osa niistä testattiin in vivo villityypin naaraspuolisilla Wistar-albiinorotilla (~12 viikkoa vanhoja, ~200 g).Medetomidiini 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Japani), midatsolaami 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Japani) ja butorfanoli 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Rotat nukutettiin Pharma (Japani) -seoksella intraperitoneaalisella injektiolla.Anestesian jälkeen ne valmisteltiin kuvantamista varten poistamalla henkitorven ympäriltä turkki, laittamalla sisään endotrakeaalinen putki (ET; 16 Ga suonensisäinen kanyyli, Terumo BCT) ja immobilisoimalla ne makuuasennossa mittatilaustyönä tehdylle kuvauslevylle, joka sisälsi lämpöpussin. kehon lämpötilan ylläpitämiseksi.22. Kuvauslevy kiinnitettiin sitten kuvantamislaatikossa olevaan näyteasteeseen pienessä kulmassa henkitorven kohdistamiseksi vaakasuoraan röntgenkuvaan, kuten kuvassa 2a esitetään.
(a) In vivo -kuvausasetus SPring-8-kuvausyksikössä, röntgensäteen polku merkitty punaisella katkoviivalla.(b, c) Henkitorven magneettipaikannus suoritettiin etänä käyttämällä kahta ortogonaalisesti asennettua IP-kameraa.Näytön kuvan vasemmalla puolella näet päätä pitävän lankasilmukan ja ET-putken sisään asennetun syöttökanyylin.
Kauko-ohjattu ruiskupumppujärjestelmä (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL), jossa käytettiin 100 ul:n lasiruiskua, yhdistettiin PE10-letkuun (0,61 mm OD, 0,28 mm sisähalkaisija) käyttämällä 30 Ga:n neulaa.Merkitse putki varmistaaksesi, että kärki on oikeassa asennossa henkitorvessa, kun asetat endotrakeaaliputken.Mikropumpun avulla ruiskun mäntä poistettiin ja putken kärki upotettiin toimitettavaan MP-näytteeseen.Ladattu annosteluputki työnnettiin sitten endotrakeaaliputkeen, jolloin kärki asetettiin odotetun käytetyn magneettikentän vahvimpaan kohtaan.Kuvanottoa ohjattiin Arduino-pohjaiseen ajastuslaatikkoomme liitetyn hengitysilmaisimen avulla, ja kaikki signaalit (esim. lämpötila, hengitys, suljin auki/sulkeminen ja kuvanotto) tallennettiin Powerlabilla ja LabChartilla (AD Instruments, Sydney, Australia). 22 Kuvattaessa Kun koteloa ei ollut saatavilla, kaksi IP-kameraa (Panasonic BB-SC382) sijoitettiin noin 90° toisiinsa nähden ja niitä käytettiin ohjaamaan magneetin asentoa henkitorveen nähden kuvantamisen aikana (kuva 2b, c).Liikkeen aiheuttamien artefaktien minimoimiseksi otettiin yksi kuva henkeä kohti terminaalisen hengitysvirtauksen aikana.
Magneetti on kiinnitetty toiseen vaiheeseen, joka voi sijaita etänä kuvantamisrungon ulkopuolella.Magneetin erilaisia ​​asentoja ja konfiguraatioita testattiin, mukaan lukien: sijoitettuna noin 30°:n kulmaan henkitorven yläpuolelle (konfiguraatiot on esitetty kuvioissa 2a ja 3a);yksi magneetti eläimen yläpuolella ja toinen alla, napat asetettu vetovoimaa varten (kuva 3b)., yksi magneetti eläimen yläpuolella ja yksi alapuolella, napojen ollessa asetettuna hylkimistä varten (kuva 3c), ja yksi magneetti henkitorven yläpuolella ja kohtisuorassa sitä vastaan ​​(kuva 3d).Kun eläin ja magneetti on asetettu ja testattava MP on ladattu ruiskupumppuun, anna 50 µl:n annos nopeudella 4 µl/s kuvien ottamisen jälkeen.Magneettia liikutetaan sitten edestakaisin henkitorvea pitkin tai poikki samalla kun jatketaan kuvien ottamista.
Magneettikokoonpano in vivo -kuvausta varten (a) yksi magneetti henkitorven yläpuolella noin 30° kulmassa, (b) kaksi magneettia, jotka on määritetty vetovoimaan, (c) kaksi magneettia, jotka on määritetty torjumaan, (d) yksi magneetti yläpuolella ja kohtisuorassa henkitorvi.Tarkkailija katsoi alas suusta keuhkoihin henkitorven kautta ja röntgensäde kulki rotan vasemman puolen läpi ja poistui oikealta puolelta.Magneettia liikutetaan joko hengitysteiden pituudella tai vasemmalle ja oikealle henkitorven yläpuolelle röntgensäteen suuntaan.
Pyrimme myös määrittämään hengitysteissä olevien hiukkasten näkyvyyden ja käyttäytymisen ilman hengityksen ja sykkeen sekoittumista.Siksi eläimet lopetettiin kuvausjakson lopussa inhimillisesti pentobarbitaalin yliannostuksen vuoksi (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 mg/kg ip).Jotkut eläimet jätettiin kuvantamisalustalle, ja hengityksen ja sydämen sykkeen lopettamisen jälkeen kuvausprosessi toistettiin lisäämällä ylimääräinen annos MP, jos MP:tä ei ollut näkyvissä hengitysteiden pinnalla.
Tuloksena saadut kuvat korjattiin tasaisen ja tumman kentän suhteen ja koottiin sitten elokuvaksi (20 kuvaa sekunnissa; 15–25 × normaali nopeus hengitystaajuudesta riippuen) käyttämällä mukautettua MATLAB-ohjelmaa (R2020a, The Mathworks).
Kaikki LV-geenivektorin kuljettamista koskevat tutkimukset suoritettiin Adelaiden yliopiston laboratorioeläintutkimuskeskuksessa, ja niiden tarkoituksena oli käyttää SPring-8-kokeen tuloksia arvioimaan, voisiko LV-MP:n kuljetus magneettikentän läsnä ollessa tehostaa geeninsiirtoa in vivo .MF:n ja magneettikentän vaikutusten arvioimiseksi käsiteltiin kahta eläinryhmää: toiseen ryhmään injektoitiin LV MF magneettisijoituksella ja toiseen ryhmään injektoitiin kontrolliryhmä LV MF:llä ilman magneettia.
LV-geenivektorit on luotu käyttämällä aiemmin kuvattuja menetelmiä 25, 26.LacZ-vektori ekspressoi tumaan lokalisoitua beeta-galaktosidaasigeeniä, jota ohjaa MPSV:n konstitutiivinen promoottori (LV-LacZ), joka tuottaa sinisen reaktiotuotteen transdusoiduissa soluissa, joka näkyy keuhkokudoksen rintamilla ja osissa.Titraus suoritettiin soluviljelmissä laskemalla manuaalisesti LacZ-positiivisten solujen lukumäärä käyttämällä hemosytometriä tiitterin laskemiseksi yksikköinä TU/ml.Kantoaineet kylmäsäilytetään -80°C:ssa, sulatetaan ennen käyttöä ja sidotaan CombiMagiin sekoittamalla 1:1 ja inkuboimalla jäillä vähintään 30 minuuttia ennen toimitusta.
Normaalit Sprague Dawley -rotat (n = 3/ryhmä, ~2-3 nukutettua ip:n seoksella, jossa on 0,4 mg/kg medetomidiinia (Domitor, Ilium, Australia) ja 60 mg/kg ketamiinia (Ilium, Australia) 1 kuukauden iässä) ip. ) injektio ja ei-kirurginen oraalinen kanylointi 16 Ga:n suonensisäisellä kanyylilla.Sen varmistamiseksi, että henkitorven hengitysteiden kudos vastaanottaa LV-transduktion, se käsiteltiin käyttämällä aiemmin kuvattua mekaanista häiriöprotokollaa, jossa henkitorven hengitysteiden pintaa hierottiin aksiaalisesti lankakorilla (N-Circle, nitinolikivipoistolaite ilman kärkeä NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) 30 s. 28.Sitten, noin 10 minuuttia bioturvallisuuskaapin häiriön jälkeen, suoritettiin LV-MP:n antaminen henkitorveen.
Tässä kokeessa käytetty magneettikenttä konfiguroitiin samalla tavalla kuin in vivo -röntgentutkimuksessa, jolloin samoja magneetteja pidettiin henkitorven päällä tislausstenttipuristimilla (kuva 4).50 ul:n tilavuus (2 x 25 ul:n alikvootteja) LV-MP:tä annettiin henkitorveen (n = 3 eläintä) käyttämällä geelikärkistä pipettiä, kuten aiemmin on kuvattu.Kontrolliryhmä (n = 3 eläintä) sai saman LV-MP:n ilman magneettia.Infuusion päätyttyä kanyyli poistetaan endotrakeaalisesta putkesta ja eläin ekstuboidaan.Magneetti pysyy paikallaan 10 minuuttia ennen kuin se irrotetaan.Rotille annettiin ihonalaisesti meloksikaamia (1 ml/kg) (Ilium, Australia), mitä seurasi anestesian poistaminen intraperitoneaalisella injektiolla 1 mg/kg atipamatsolihydrokloridia (Antisedan, Zoetis, Australia).Rottia pidettiin lämpimänä ja tarkkailtiin, kunnes ne toipuivat täydellisesti anestesiasta.
LV-MP jakelulaite biologisessa turvakaappissa.Näet, että ET-putken vaaleanharmaa Luer-lock-holkki työntyy ulos suusta ja kuvan mukainen geelipipetin kärki työnnetään ET-putken läpi haluttuun syvyyteen henkitorveen.
Viikko LV-MP-antomenettelyn jälkeen eläimet tapettiin inhimillisesti hengittämällä 100 % C02:ta ja LacZ:n ilmentyminen arvioitiin käyttämällä standardia X-gal-käsittelyämme.Kolme kaudaalisinta rustorengasta poistettiin sen varmistamiseksi, että analyysiin ei sisällytetä mitään mekaanisia vaurioita tai nesteen kertyminen endotrakeaaliputken sijoittamisesta.Jokainen henkitorvi leikattiin pituussuunnassa kahden puolikkaan saamiseksi analysointia varten ja asetettiin silikonikumia sisältävään kuppiin (Sylgard, Dow Inc) käyttämällä Minutien-neulaa (Fine Science Tools) valopinnan visualisoimiseksi.Transdusoitujen solujen jakautuminen ja luonne varmistettiin etuvalokuvauksella Nikon-mikroskoopilla (SMZ1500) DigiLite-kameralla ja TCapture-ohjelmistolla (Tucsen Photonics, Kiina).Kuvat hankittiin 20-kertaisella suurennuksella (mukaan lukien henkitorven koko leveyden maksimiasetus), jolloin henkitorven koko pituus näytettiin askel askeleelta, mikä tarjosi riittävästi päällekkäisyyttä kunkin kuvan välillä, jotta kuvat voidaan "ompelemaan".Kunkin henkitorven kuvat yhdistettiin sitten yhdeksi yhdistelmäkuvaksi käyttämällä Composite Image Editorin versiota 2.0.3 (Microsoft Research) käyttäen tasoliikealgoritmia. LacZ-ilmentymisalue kunkin eläimen henkitorven yhdistelmäkuvissa kvantifioitiin käyttämällä automatisoitua MATLAB-komentosarjaa (R2020a, MathWorks) aiemmin kuvatulla tavalla28 käyttämällä asetuksia 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15 ja Value < 0,7. LacZ-ilmentymisen pinta-ala kunkin eläimen henkitorven yhdistelmäkuvissa kvantifioitiin käyttämällä automatisoitua MATLAB-skriptiä (R2020a, MathWorks) aiemmin kuvatulla tavalla28 käyttämällä asetuksia 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15 ja Value < 0,7. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0 ,7. LacZ-ilmentymisen pinta-ala kunkin eläimen yhdistelmäkuvissa henkitorvessa määritettiin käyttämällä automatisoitua MATLAB-komentosarjaa (R2020a, MathWorks) aiemmin kuvatulla tavalla28 käyttämällä 0,35-asetuksia.0,15 ja arvo < 0 ,7.如 前所 述 ， 使用 自动 Matlab 脚本 （R2020a ， Mathworks） 对 来自 每 只 动物 的 复合 图像 中 的 的 的 的 表达 区域 进行 量化 ， 使用 使用 使用 中 的 的 的 的 表达 进行 量化 ， 使用 使用 0,35 <色调 <0,58 、 饱和度> 0,15 和值 <0如 前所 述 ， 自动 自动 Matlab 脚本 （（R2020A ， Mathworks） 来自 每 只 的 气管 图像 的 的 的 的 表达 量化 ， 使用 使用 使用 0,35 <色调 <0,58 、> 0,15 和值 <0,7 的 。。。。。 。。。。。 。。。。。 。。。。。 。。。。。 。。。。。 。。。。。 。。。。。 。。。。。 。。。。。 。。。。。 。。。。。 。…………………………………………………………………………………………………………………… Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7 . LacZ-ilmentymisen alueet kunkin eläimen henkitorven yhdistelmäkuvissa kvantifioitiin käyttämällä automatisoitua MATLAB-komentosarjaa (R2020a, MathWorks), kuten aiemmin on kuvattu käyttämällä asetuksia 0,35 < sävy < 0,58, kylläisyys > 0,15 ja arvo < 0,7 .Seuraamalla kudosten ääriviivoja GIMP v2.10.24:ssä, jokaiselle yhdistelmäkuvalle luotiin manuaalisesti maski kudosalueen tunnistamiseksi ja väärien havaitsemisen estämiseksi henkitorven kudoksen ulkopuolella.Kaikkien yhdistelmäkuvien värjätyt alueet kustakin eläimestä laskettiin yhteen, jolloin saatiin kyseisen eläimen värjäytyneen alueen kokonaismäärä.Maalattu alue jaettiin sitten maskin kokonaispinta-alalla normalisoidun alueen saamiseksi.
Jokainen henkitorvi upotettiin parafiiniin ja leikattiin 5 um paksuiksi.Leikkeet vastavärjättiin neutraalilla nopealla punaisella 5 minuutin ajan ja kuvat otettiin käyttämällä Nikon Eclipse E400 -mikroskooppia, DS-Fi3-kameraa ja NIS-elementtien sieppausohjelmistoa (versio 5.20.00).
Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin GraphPad Prism v9:ssä (GraphPad Software, Inc.).Tilastollinen merkitsevyys asetettiin arvoon p < 0,05.Normaalisuus testattiin Shapiro-Wilk-testillä ja erot LacZ-värjäytymisessä arvioitiin käyttämällä paritonta t-testiä.
PCXI:llä tutkittiin kuusi taulukossa 1 kuvattua MP:tä, ja näkyvyys on kuvattu taulukossa 2. PCXI ei nähnyt kahta polystyreeni-MP:tä (MP1 ja MP2; 18 µm ja 0,25 µm, vastaavasti), mutta loput näytteet pystyttiin tunnistamaan. (esimerkkejä on esitetty kuvassa 5).MP3 ja MP4 ovat heikosti näkyviä (10-15 % Fe3O4; 0,25 µm ja 0,9 µm, vastaavasti).Vaikka MP5 (98 % Fe3O4; 0,25 µm) sisälsi joitain pienimmistä testatuista hiukkasista, se oli selkein.CombiMag MP6 -tuotetta on vaikea erottaa.Kaikissa tapauksissa kykymme havaita MF:t parani huomattavasti liikuttamalla magneettia edestakaisin kapillaarin suuntaisesti.Kun magneetit siirtyivät pois kapillaarista, hiukkaset vedettiin ulos pitkinä ketjuina, mutta magneettien lähestyessä ja magneettikentän voimakkuuden lisääntyessä hiukkasketjut lyhenivät hiukkasten siirtyessä kohti kapillaarin yläpintaa (katso lisävideo S1 : MP4), mikä lisää hiukkastiheyttä pinnalla.Päinvastoin, kun magneetti poistetaan kapillaarista, kentänvoimakkuus pienenee ja MP:t järjestäytyvät pitkiksi ketjuiksi, jotka ulottuvat kapillaarin yläpinnasta (katso täydentävä video S2: MP4).Magneetin pysähtymisen jälkeen hiukkaset jatkavat liikkumista jonkin aikaa saavutettuaan tasapainoasennon.Kun MP liikkuu kohti ja poispäin kapillaarin yläpintaa, magneettiset hiukkaset pyrkivät vetämään roskia nesteen läpi.
MP:n näkyvyys PCXI:n alla vaihtelee huomattavasti näytteiden välillä.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 ja (d) MP6.Kaikki tässä näkyvät kuvat on otettu magneetilla, joka on sijoitettu noin 10 mm suoraan kapillaarin yläpuolelle.Näennäiset suuret ympyrät ovat ilmakuplia, jotka ovat jääneet kapillaareihin, ja ne osoittavat selvästi vaihekontrastikuvan mustavalkoiset reunapiirteet.Punainen laatikko osoittaa kontrastia lisäävän suurennuksen.Huomaa, että magneettipiirien halkaisijat kaikissa kuvissa eivät ole mittakaavassa ja ovat noin 100 kertaa suuremmat kuin esitetty.
Kun magneetti liikkuu vasemmalle ja oikealle pitkin kapillaarin yläosaa, MP-nauhan kulma muuttuu kohdakkain magneetin kanssa (katso kuva 6), mikä rajaa magneettikenttäviivat.MP3-5:ssä, kun jänne saavuttaa kynnyskulman, hiukkaset vetävät pitkin kapillaarin yläpintaa.Tämä johtaa usein MP:iden ryhmittymiseen suurempiin ryhmiin lähellä paikkaa, jossa magneettikenttä on voimakkain (katso lisävideo S3: MP5).Tämä on erityisen ilmeistä myös kuvattaessa lähellä kapillaarin päätä, mikä saa MP:n aggregoitumaan ja keskittymään neste-ilma-rajapinnalle.MP6:n hiukkaset, joita oli vaikeampi erottaa kuin MP3-5:ssä, eivät vetäytyneet, kun magneetti liikkui kapillaaria pitkin, mutta MP-jonot dissosioituivat jättäen hiukkaset näkyville (katso täydentävä video S4: MP6).Joissakin tapauksissa, kun käytettyä magneettikenttää pienennettiin siirtämällä magneettia pitkän matkan kuvantamiskohdasta, jäljelle jääneet MP:t laskeutuivat hitaasti putken pohjapinnalle painovoiman vaikutuksesta ja jäivät merkkijonoon (katso lisävideo S5: MP3) .
MP-nauhan kulma muuttuu, kun magneetti liikkuu oikealle kapillaarin yläpuolelle.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 ja (d) MP6.Punainen laatikko osoittaa kontrastia lisäävän suurennuksen.Huomaa, että lisävideot ovat tiedotustarkoituksessa, koska ne paljastavat tärkeän hiukkasrakenteen ja dynaamisen tiedon, jota ei voida visualisoida näissä staattisissa kuvissa.
Testimme ovat osoittaneet, että magneetin liikuttaminen edestakaisin hitaasti henkitorvea pitkin helpottaa MF:n visualisointia monimutkaisen liikkeen yhteydessä in vivo.In vivo -testejä ei suoritettu, koska polystyreenihelmet (MP1 ja MP2) eivät näkyneet kapillaarissa.Jokainen jäljellä olevista neljästä MF:stä testattiin in vivo magneetin pitkän akselin ollessa henkitorven päällä noin 30° kulmassa pystysuoraan nähden (katso kuvat 2b ja 3a), koska tämä johti pidempiin MF-ketjuihin ja oli tehokkaampi. kuin magneetti..konfigurointi lopetettu.MP3-, MP4- ja MP6-tiedostoja ei ole löydetty elävien eläinten henkitorvesta.Kun rottien hengitysteitä visualisoitiin eläinten inhimillisen tappamisen jälkeen, hiukkaset pysyivät näkymättöminä, vaikka lisätilavuutta lisättiin ruiskupumpulla.MP5:llä oli korkein rautaoksidipitoisuus ja se oli ainoa näkyvä hiukkanen, joten sitä käytettiin MP-käyttäytymisen arvioimiseen ja karakterisointiin in vivo.
Magneetin sijoittaminen henkitorven päälle MF:n asettamisen aikana johti siihen, että monet, mutta eivät kaikki, MF:t keskittyivät näkökenttään.Hiukkasten pääsy henkitorveen havaitaan parhaiten inhimillisesti lopetetuilla eläimillä.Kuva 7 ja täydentävä video S6: MP5 näyttää nopean magneettisen sieppauksen ja hiukkasten kohdistuksen ventraalisen henkitorven pinnalla, mikä osoittaa, että MP:t voidaan kohdistaa henkitorven halutuille alueille.Kun etsittiin kauempana henkitorvea pitkin MF-antamisen jälkeen, jotkut MF:t löydettiin lähempänä karinaa, mikä osoittaa riittämättömän magneettikentän voimakkuuden keräämään ja pitämään kaikki MF:t, koska ne kuljetettiin suurimman magneettikentän voimakkuuden alueen läpi nesteen antamisen aikana.prosessi.Synnytyksen jälkeiset MP-pitoisuudet olivat kuitenkin korkeammat kuva-alueen ympärillä, mikä viittaa siihen, että monet MP:t jäivät hengitysteiden alueille, joilla käytetty magneettikentän voimakkuus oli suurin.
Kuvat (a) ennen ja (b) MP5:n toimituksen jälkeen äskettäin lopetetun rotan henkitorveen magneetilla, joka on sijoitettu juuri kuvausalueen yläpuolelle.Kuvattu alue sijaitsee kahden rustorenkaan välissä.Hengitysteissä on nestettä ennen MP:n toimittamista.Punainen laatikko osoittaa kontrastia lisäävän suurennuksen.Nämä kuvat on otettu S6: MP5 Supplementary Video -videossa esitetystä videosta.
Magneetin liikuttaminen henkitorvea pitkin in vivo johti muutokseen MP-ketjun kulmassa hengitysteiden pinnalla, joka on samanlainen kuin kapillaareissa havaittu (katso kuva 8 ja täydentävä video S7: MP5).Kuitenkaan tutkimuksessamme MP:itä ei voitu vetää pitkin elävien hengitysteiden pintaa, kuten kapillaareja voisi tehdä.Joissakin tapauksissa MP-ketju pitenee magneetin liikkuessa vasemmalle ja oikealle.Mielenkiintoista on, että havaitsimme myös, että hiukkasketju muuttaa nesteen pintakerroksen syvyyttä, kun magneettia liikutetaan pituussuunnassa henkitorvea pitkin, ja laajenee, kun magneettia siirretään suoraan pään yläpuolelle ja hiukkasketju käännetään pystyasentoon (ks. Täydentävä video S7).: MP5 klo 0:09, alhaalla oikealla).Tyypillinen liikekuvio muuttui, kun magneettia siirrettiin sivusuunnassa henkitorven yläosan poikki (eli eläimen vasemmalle tai oikealle puolelle henkitorven pituuden sijaan).Hiukkaset olivat edelleen selvästi näkyvissä niiden liikkeen aikana, mutta kun magneetti poistettiin henkitorvesta, hiukkasjonojen kärjet tulivat näkyviin (katso lisävideo S8: MP5, alkaen 0:08).Tämä sopii yhteen magneettikentän havaitun käyttäytymisen kanssa lasikapillaarissa käytetyn magneettikentän vaikutuksesta.
Esimerkkikuvia, joissa näkyy MP5 elävän nukutetun rotan henkitorvessa.(a) Magneettia käytetään kuvien ottamiseksi henkitorven yläpuolella ja vasemmalla puolella, sitten (b) sen jälkeen, kun magneettia on siirretty oikealle.Punainen laatikko osoittaa kontrastia lisäävän suurennuksen.Nämä kuvat ovat videosta, joka on esillä S7:n lisävideossa: MP5.
Kun kaksi napaa viritettiin pohjois-etelä-suuntaan henkitorven ylä- ja alapuolella (eli houkuttelevat; kuva 3b), MP-painteet näyttivät pidemmiltä ja sijaitsivat henkitorven sivuseinällä pikemminkin kuin henkitorven selkäpinnalla. henkitorvi (katso liite).Video S9:MP5).Suuria hiukkaspitoisuuksia yhdessä kohdassa (eli henkitorven selkäpinnalla) ei kuitenkaan havaittu sen jälkeen, kun nestettä oli annettu kaksoismagneettilaitteella, mikä tapahtuu tavallisesti yhdellä magneettilaitteella.Sitten, kun yksi magneetti konfiguroitiin hylkimään vastakkaisia ​​napoja (kuva 3c), näkökentässä näkyvien hiukkasten määrä ei lisääntynyt toimituksen jälkeen.Molempien magneettikokoonpanojen asettaminen on haastavaa korkean magneettikentän voimakkuuden vuoksi, joka vetää puoleensa tai työntää magneetteja.Asetus muutettiin sitten yhdeksi magneetiksi, joka oli yhdensuuntainen hengitysteiden kanssa, mutta joka kulki hengitysteiden läpi 90 asteen kulmassa siten, että voimalinjat ylittivät henkitorven seinämän kohtisuorassa (kuva 3d), suuntauksen tarkoituksena oli määrittää hiukkasten aggregoitumisen mahdollisuus sivuseinämä.huomioida.Tässä kokoonpanossa ei kuitenkaan ollut tunnistettavissa olevaa MF-akkumulaatioliikettä tai magneetin liikettä.Kaikkien näiden tulosten perusteella geeninkantajien in vivo -tutkimuksiin valittiin konfiguraatio, jossa oli yksi magneetti ja 30 asteen suuntaus (kuvio 3a).
Kun eläin kuvattiin useita kertoja välittömästi inhimillisen lopettamisen jälkeen, häiritsevän kudosliikkeen puuttuminen tarkoitti sitä, että selkeässä rustonvälisessä kentässä voitiin havaita hienompia, lyhyempiä hiukkasviivoja, jotka "heiluivat" magneetin translaatioliikkeen mukaisesti.näet selvästi MP6-hiukkasten läsnäolon ja liikkeen.
LV-LacZ:n tiitteri oli 1,8 x 108 IU/ml, ja sen jälkeen, kun se oli sekoitettu 1:1 CombiMag MP:n (MP6) kanssa, eläimiin injektoitiin 50 µl 9 x 107 IU/ml LV-vehikkeliä (eli 4,5). x 106 TU/rotta).).).Näissä tutkimuksissa sen sijaan, että liikuttaisimme magneettia synnytyksen aikana, kiinnitimme magneetin yhteen asentoon määrittääksemme, voisiko LV-transduktiota (a) parantaa verrattuna vektorin siirtoon ilman magneettikenttää ja (b) voisiko ilmatiet olla keskittynyt.Solut transdusoidaan ylempien hengitysteiden magneettisilla kohdealueilla.
Magneettien läsnäolo ja CombiMagin käyttö yhdessä LV-vektoreiden kanssa eivät näyttäneet vaikuttavan haitallisesti eläinten terveyteen, kuten myös standardi LV-vektorin antoprotokollamme.Etukuvat henkitorven alueesta, joka oli alttiina mekaaniselle häiriölle (lisäkuva 1), osoittivat, että LV-MP-käsitellyllä ryhmällä oli merkittävästi korkeammat transduktiotasot magneetin läsnä ollessa (kuvio 9a).Vain pieni määrä sinistä LacZ-värjäystä oli läsnä kontrolliryhmässä (kuvio 9b).X-Gal-värjäytyneiden normalisoitujen alueiden kvantifiointi osoitti, että LV-MP:n antaminen magneettikentän läsnä ollessa johti noin 6-kertaiseen parannukseen (kuvio 9c).
Esimerkki yhdistelmäkuvista, jotka esittävät henkitorven transduktiota LV-MP:llä (a) magneettikentän läsnä ollessa ja (b) magneetin puuttuessa.(c) Tilastollisesti merkitsevä parannus LacZ-transduktion normalisoidussa alueella henkitorvessa magneetin avulla (*p = 0,029, t-testi, n = 3 ryhmää kohti, keskiarvo ± keskiarvon standardivirhe).
Neutraalit nopeasti punaiseksi värjäytyneet leikkeet (esimerkki lisäkuvassa 2) osoittivat, että LacZ-värjätyt solut olivat läsnä samassa näytteessä ja samassa paikassa kuin aiemmin raportoitiin.
Hengitysteiden geeniterapian avainhaaste on edelleen kantajahiukkasten tarkka paikantaminen kiinnostaville alueille ja korkean transduktiotehokkuuden saavuttaminen liikkuvissa keuhkoissa ilmavirran ja aktiivisen liman puhdistuman läsnä ollessa.Kystisen fibroosin hengityselinten sairauksien hoitoon tarkoitetuille LV-kantajille kantajahiukkasten viipymäajan pidentäminen johtavissa hengitysteissä on tähän asti ollut saavuttamaton tavoite.Kuten Castellani et ai. ovat huomauttaneet, magneettikenttien käytöllä transduktion tehostamiseksi on etuja muihin geeninkuljetusmenetelmiin, kuten elektroporaatioon, verrattuna, koska se voi yhdistää yksinkertaisuuden, taloudellisuuden, paikallisen jakelun, lisääntyneen tehokkuuden ja lyhyemmän inkubaatioajan.ja mahdollisesti pienempi annos vehikkeliä10.Kuitenkaan ei ole koskaan kuvattu magneettisten hiukkasten in vivo kerääntymistä ja käyttäytymistä hengitysteihin ulkoisten magneettivoimien vaikutuksesta, ja itse asiassa tämän menetelmän kykyä lisätä geenin ilmentymistasoja koskemattomissa elävissä hengitysteissä ei ole osoitettu in vivo.
In vitro -kokeemme PCXI-synkrotronilla osoittivat, että kaikki testaamamme hiukkaset MP-polystyreeniä lukuun ottamatta olivat näkyvissä käyttämämme kuvantamisasetuksissa.Magneettikentän läsnäollessa magneettikentät muodostavat ketjuja, joiden pituus riippuu hiukkasten tyypistä ja magneettikentän voimakkuudesta (eli magneetin läheisyydestä ja liikkeestä).Kuten kuvasta 10 näkyy, havaitsemamme merkkijonot muodostuvat, kun jokainen yksittäinen hiukkanen magnetoituu ja indusoi oman paikallisen magneettikenttänsä.Nämä erilliset kentät saavat muut samankaltaiset hiukkaset kerääntymään ja liittymään ryhmän liikkeisiin paikallisten muiden hiukkasten veto- ja hylkimisvoimien aiheuttamien paikallisten voimien vuoksi.
Kaavio, joka esittää (a, b) hiukkasten ketjut, jotka muodostuvat nesteellä täytettyjen kapillaarien sisällä, ja (c, d) ilmatäytteisen henkitorven.Huomaa, että kapillaareja ja henkitorvea ei ole vedetty mittakaavassa.Paneeli (a) sisältää myös kuvauksen MF:stä, joka sisältää Fe304-hiukkasia ketjuihin järjestetyssä.
Kun magneetti liikkui kapillaarin yli, hiukkasnauhan kulma saavutti kriittisen kynnyksen Fe3O4:a sisältävälle MP3-5:lle, minkä jälkeen hiukkasjono ei enää pysynyt alkuperäisessä asennossaan, vaan siirtyi pintaa pitkin uuteen asentoon.magneetti.Tämä vaikutus tapahtuu todennäköisesti, koska lasikapillaarin pinta on riittävän sileä sallimaan tämän liikkeen.Mielenkiintoista on, että MP6 (CombiMag) ei käyttäytynyt tällä tavalla, ehkä siksi, että hiukkaset olivat pienempiä, niillä oli erilainen pinnoite tai pintavaraus tai patentoitu kantajaneste vaikutti niiden liikkumiskykyyn.Myös CombiMag-hiukkaskuvan kontrasti on heikompi, mikä viittaa siihen, että nesteellä ja hiukkasilla voi olla sama tiheys, eivätkä ne siksi pääse helposti liikkumaan toisiaan kohti.Hiukkaset voivat myös takertua, jos magneetti liikkuu liian nopeasti, mikä osoittaa, että magneettikentän voimakkuus ei aina voi voittaa nesteen hiukkasten välistä kitkaa, mikä viittaa siihen, että magneettikentän voimakkuuden ja magneetin ja kohdealueen välisen etäisyyden ei pitäisi olla yllätys.tärkeä.Nämä tulokset osoittavat myös, että vaikka magneetit voivat vangita monia kohdealueen läpi virtaavia mikrohiukkasia, on epätodennäköistä, että magneetteihin voidaan luottaa siirtämään CombiMag-hiukkasia henkitorven pintaa pitkin.Näin ollen päätimme, että in vivo LV MF -tutkimuksissa tulisi käyttää staattisia magneettikenttiä fyysisesti kohdistamaan tiettyjä hengitystiepuun alueita.
Kun hiukkaset ovat joutuneet kehoon, niitä on vaikea tunnistaa kehon monimutkaisen liikkuvan kudoksen yhteydessä, mutta niiden havaitsemiskykyä on parannettu siirtämällä magneettia vaakasuunnassa henkitorven yli MP-jonojen "heiluttamiseksi".Vaikka reaaliaikainen kuvantaminen on mahdollista, on helpompi havaita hiukkasten liike sen jälkeen, kun eläin on tapettu inhimillisesti.MP-pitoisuudet olivat yleensä korkeimmat tässä paikassa, kun magneetti sijoitettiin kuvantamisalueen päälle, vaikka joitain hiukkasia löydettiin yleensä alempana henkitorvesta.Toisin kuin in vitro -tutkimuksissa, hiukkasia ei voida vetää alas henkitorvea magneetin liikkeellä.Tämä havainto on yhdenmukainen sen kanssa, kuinka henkitorven pintaa peittävä lima tyypillisesti prosessoi sisäänhengitettyjä hiukkasia, vangitsee ne limaan ja puhdistaa ne sitten liman ja siliaarisen puhdistumamekanismin kautta.
Oletimme, että henkitorven ylä- ja alapuolella olevien magneettien käyttäminen vetovoimaan (kuva 3b) voisi johtaa tasaisempaan magneettikenttään pikemminkin kuin magneettikentässä, joka on erittäin keskittynyt yhteen pisteeseen, mikä mahdollisesti johtaa hiukkasten tasaisempaan jakautumiseen..Alustava tutkimuksemme ei kuitenkaan löytänyt selkeää näyttöä tämän hypoteesin tueksi.Vastaavasti magneettiparin asettaminen hylkiväksi (kuva 3c) ei johtanut enemmän hiukkasten laskeutumiseen kuva-alueelle.Nämä kaksi havaintoa osoittavat, että kaksoismagneettiasetus ei merkittävästi paranna MP-osoittamisen paikallista ohjausta ja että tuloksena olevia vahvoja magneettisia voimia on vaikea virittää, mikä tekee tästä lähestymistavasta vähemmän käytännöllisen.Samoin magneetin suuntaaminen henkitorven yläpuolelle ja poikki (kuva 3d) ei myöskään lisännyt kuvatulla alueella jäljellä olevien hiukkasten määrää.Jotkut näistä vaihtoehtoisista kokoonpanoista eivät ehkä onnistu, koska ne johtavat magneettikentän voimakkuuden heikkenemiseen pinnoitusvyöhykkeellä.Siten yhden magneetin konfiguraatiota 30 asteessa (kuva 3a) pidetään yksinkertaisimpana ja tehokkaimpana in vivo -testausmenetelmänä.
LV-MP-tutkimus osoitti, että kun LV-vektorit yhdistettiin CombiMagiin ja annettiin sen jälkeen, kun niitä oli fyysisesti häiritty magneettikentän läsnä ollessa, transduktiotasot lisääntyivät merkittävästi henkitorvessa verrokkeihin verrattuna.Synkrotronikuvaustutkimusten ja LacZ-tulosten perusteella magneettikenttä näytti pystyvän pitämään LV:n henkitorvessa ja vähentämään välittömästi syvälle keuhkoihin tunkeutuneiden vektorihiukkasten määrää.Tällaiset kohdistusparannukset voivat johtaa parempaan tehokkuuteen samalla, kun ne vähentävät toimitettuja tiittereitä, ei-kohdennettua transduktiota, tulehdus- ja immuunisivuvaikutuksia sekä geeninsiirtokustannuksia.Tärkeää on, että valmistajan mukaan CombiMagia voidaan käyttää yhdessä muiden geeninsiirtomenetelmien kanssa, mukaan lukien muut virusvektorit (kuten AAV) ja nukleiinihapot.